1.- Catálisis ácido-base.

1. Tema-7. MECANISMOS DE ACCIÓN ENZIMÁTICA 1.- Catálisis ácido-base. 2.- Catálisis covalente .. 3.- Catálisis por iones metálicos. .. 4. Efecto Túnel y catálisis enzimática

2. 1. CATÁLISIS ACIDO-BASE Desde antiguo se conoce que muchas reacciones orgánicas son catalizadas por ácidos (H3O+) o por bases (OH-). De hecho, hay muchas reacciones orgánicas en las que protones e hidroxilos son los únicos catalizadores efectivos. * Para fijar ideas consideremos la hidrólisis de un éster: R1-COOR2 + H2O R1-COOH + R2-OH Esta reacción que parece tan simple, no lo es si se analiza un poco en profundidad y se contempla la actuación del H2O en las diferentes etapas de la reacción.

3. a)Reacción sin catalizar: A pH neutro, la reacción, de manera simplificada, puede describirse de la siguiente manera: i) El átomo de oxígeno del grupo carbonilo (=C=O) debido a su alta electroafinidad hace que el C-carbonílico presente una cierta carga positiva (d+). ii) Esta zona de carga positiva, (d+), es atacada por los electrones desapareados del átomo de oxígeno de una molécula de agua, en un ataque nucleofílico. iii) Tras el ataque, se forma un “complejo activado o estado de transición” con cargas + y – en la molécula, dando lugar un reordenamiento de enlaces, que finalmente conduce a la sustitución del grupo –OR2 por un grupo –OH. “Por lo tanto, la reacción global es una reacción de Sustitución Nucleófila, SN.”

4. - Analicemos todo esto con algo de detalle: * Para que la sustitución del grupo –OR2 por un grupo –OH haya podido tener lugar, ha sido necesario la formación de un “estado estacionario” con cargas + y -, muy próximas. ¿Qué consecuencias puede tener esto? Este “estado de transición” es un compuesto muy inestable ya que las cargas están muy próximas, y por tanto su formación requerirá una elevada energía de activación. Como consecuencia, la velocidad de este paso, y consecuentemente de la reacción global, será muy lenta, => la hidrólisis espontánea de un éster es un proceso muy lento. ......, salvo que esté catalizada.

5. b)Reacción catalizada por un ácido: * Los ácidos pueden catalizar este tipo de reacciones donando temporal un protón. Debido a la presencia del protón, la forma protonada del éster puede ser atacada por una molécula de agua, de una manera análoga a la descrita anteriormente, ya que el C-carbonílico del éster sigue presentando cierta carga +. - El estado de transición, intermedio con doble carga, + y -, altamente inestable, no se forma en este caso, por lo tanto la energía de activación será más baja. c)Hidrólisis básica: Las bases catalizan las reacciones aceptando temporalmente un protón. En el caso de la hidrólisis de un éster por una base (X-O-), la base cataliza la reacción contribuyendo a la estabilización del estado de transición de doble carga.

6. La catálisis exclusivamente debida a la presencia de un ácido se denomina “catálisis ácida específica” La catálisis exclusivamente debida a la presencia de una base se denomina “catálisis básica específica” * La velocidad de reacción en el caso de la catálisis ácida específica y catálisis básica específica viene expresada por las siguientes ecuaciones: vac = k0 (S) + kH+(H3O+)(S) vba = k0 (S) + kOH-(OH-)(S) donde: - k0 es la constante de velocidad de la reacción no-catalizada - kH+ es la constante de la reacción catalizada por el ácido - kOH- es la constante de la reacción catalizada por la base - (S) sustrato, (en nuestro caso un éster).

7. Las constantes observadas para las catálisis ácida y básicas son: vac = [k0 + kH+(H3O+)] (S) vba = [k0 + kOH-(OH-)] (S) vac = kobs(S) vba = kobs(S) kobs = k0 + kH+(H3O+) kobs = k0 + kOH-(OH-) Hasta aquí nos hemos referido a ácido como toda sustancia capaz de ceder protones (H+) y base como toda sustancia capaz de producir hidroxilos (OH-)  concepto acido/base según Arrhenius.

8. * Pero, además de los efectos específicos de protones e hidroxilos, con frecuencia, es posible detectar efectos catalíticos, es decir, estabilización del estado de transición, por ácidos y bases de Brönsted. Recordemos: - Ácido es toda sustancia capaz de ceder protones - Base es toda sustancia capaz de aceptar protones * Por otro lado, con frecuencia es necesaria la presencia simultánea de ácidos y bases para que pueda tener lugar la catálisis. En este caso hablamos de catálisis ácido-base concertada. Así, muchas reacciones que tienen lugar en el interior de las enzimas suponen la formación de compuestos intermediarios inestables con cargas eléctricas (positivas o negativas) que se pueden considerar como estados de transición.

9. * Estos compuestos pueden formarse por donación de protones desde restos aminoacídicos ácidos del centro activo de la enzima, tales como: - grupos carboxílicos (-COOH)  Glu, Asp - grupos imidazólicos protonados  His - grupos fenólicos (Ph-OH)  Tyr - grupos guanidinios protonados  Arg - grupos aminos protonados (-NH3+)  Lys Estos grupos pueden convertirse potencialmente en donadores de protones en una catálisis ácida. Por otra parte: - grupos carboxilato (-COO-)  Glu, Asp - grupo imidazol  His - grupo guanidino  Arg - Grupo amino (-NH2)  Lys Pueden servir de aceptores de protones en una catálisis básica.

11. * La presencia de restos aminoacídicos cargados en el centro activo puede estabilizar el estado de transición, y por tanto contribuir a la catálisis enzimática. La catálisis enzimática debida a un mecanismo de catálisis ácido-base concertada, es muy frecuente, y como ejemplo podemos ver la hidrólisis de un éster por una esterasa:

15. 2. CATÁLISIS COVALENTE * En la catálisis covalente, el ataque de un grupo nucleófilo (cargado -) o electrófilo (cargado +) del centro activo de la enzima sobre el sustrato conduce a la unión covalente del sustrato a la enzima * La catálisis covalente implica la estabilización del complejo activado ES# por la formación de un compuesto intermediario covalentemente unido a la enzima.

16. d+ Y + B-X <====> Y--B--X <====> Y-B + X .. -Ser-OH .. d+ B-X -Thr-OH .. + E -Tyr-OH .. -Cys-SH .. -His-NH -Consideremos la siguiente reacción no catalizada: - Si esta reacción puede ser catalizada por una enzima, el sustrato B-X debe ser susceptible de ataque por un nucleófilo de la enzima:

17. d+ E-N: + B-X <==> X + E-N-B + Y <==> Y-B + E-N: Para que haya un aumento de la velocidad de reacción, la enzima debe ser un buen nucleófilo, y también un buen grupo saliente. E-N: (grupo nucleofílico) Así pues, en presencia de la enzima: La estabilidad del compuesto intermedio E-N-B nos dice que N: , es …….. - mejor nucleófilo que Y - mejor grupo saliente que X - Existe un elevado número de reacciones enzimáticas que transcurren a través de catálisis covalente, formándose, fundamentalmente, los siguientes tipos de derivados covalentes:

18. Acil-Enzima • Serín y cisteín proteasas: • Papaína (EC 3.4.21.5, Trombina (EC 3.4.21.5), etc • Esterasas • Fosforil-Enzima • Fosfoglicerato mutasa (E.C 5.4.2.1), Residuos de serina Fosfoglucomutasa (EC5.4.2.2) Residuos de Histidina. • ATP citrato liasa (E.C 4.1.3.8) Restos carboxílicos del glutámico. • Glucosil-Enzima • Bases de Schiff entre la E y algún Sustrato • Acetoacetato descarboxilasa (E.C. 4.1.1.4) • Lisina (Grupo amino forma una base de Shiff con carboxilo del substrato.

19. 3. CATÁLISIS POR IONES METÁLICOS Un tercio de las enzimas requieren metales para la catálisis Metales capaces de estabilizar los complejos de transición • Funcionan como ácidos de Lewis (igual función protones) • Mayor concentración a pH neutro (pH celular) Mayor carga B) Unir moléculas de agua fuente de OH- (aún a pH ácidos) Anhidrasa carbónica EC 4.2.1.1) E-Zn2+—OH- + CO2 E-Zn2+ + HCO3- Hidroxilo unido al metal agente nucleofílico C) Proteger cargas negativa de substratos impidiendo repelen el par de electrones de los nucleófílos

20. 4. Efecto Tunel y Catálisis enzimática Teoria del Estado de transición cuestionando? En mecánica cuántica, el efecto túnel es un fenómeno nanoscópico por el que una partícula viola los principios de la mecánica clásica penetrando una barrera potencial o impedancia mayor que la energía cinética de la propia partícula. Particulas elementales pueden ser consideradas como partículas o como ondas . Como ondas pueden atravesar barreras energéticas Enzimas tiene elastplasticidad interna y presentan pequeños cambios conformacionales (Breathing) Barrera energética es fluctuante y algunos efectos catalíticos pueden tener lugar por el efecto túnel a través de la barrera energética

21. Alcohol deshidrogenasa de Bacilllus sterathermophilus Efecto tunel a los 65 grados centigrados Fluctuaciones de la estructura causadas por la excitación térmica tienen un papel importante en la ruptura catalítica del enlace carbono-hidrógeno DINÁMICA DE LAS PROTEÍNAS IDENTIFICAR TIPOS DE VIBRACIÓN EN LA MOLECULA ES EP ES EP Energía potencial ● X FACILITAN EFECTO TUNEL Configuración nuclear El efecto túnel no acontece hasta que la geometría de la molécula es distorsionada de manera que la energía potencial de los complejos ES y EP interseccionan, Temperatura es indenpediente del efecto tunel , pero facilita cambios conformacionales

22. TAMAÑO DE LAS ENZIMAS ¿Por qué es necesario una macromolécula para que tenga la acción catalítica? 12-20 kD Límite inferior Distribución está muy bien conservada 50% Tiene masas moleculares entre 30-50 kD Enzimas > 80 kD Multifuncionales Tamaño de la proteína es necesario para completa conformación espacial del centro activo Citrato sintasasa 437 aa 8 aa Interactuar citrato 8 aa Interactuar Acetil CoA Repartidos posiciones desde 46-421 Toda la proteína es necesaria para que los 16 aminoácidos implicados en la catálisis adquieran conformación activa Mayor es una enzima Mayor especificidad Número de contactos específicos Tripsina proteasa poco específica (233 aminoácidos) Plasmina muy especifica 714 aminoácidos Especificidad se logra aumentando el número de puntos de interacción

23. RESUMEN TEMA La estabilización del estado de transición puede llevarse a cabo por medio de una catálisis ácido-base concertada (en el centro activo pueden existir aminoácidos en la forma ácida o en la forma básica), Mediante la formación de un complejo covalente intermedio: acil enzimas, fosforil enzimas o del tipo de bases de Schiff, el intermediario covalente sería el complejo activado. Catálisis Metálica: Metales funcionan como ácidos Lewis. Une moléculas de agua y convierten en fuentes de hidroxilo aún por debajo del pH neutro. Recientemente se ha acudido al efecto túnel que presentan partículas pequeñas para explicar la acción enzimática. Los cambios conformacionales de la enzima pueden inducir a átomos de Hidrogeno a atravesar la barrera energética, de tal manera que la energía potencial de los complejos ES y EP coincidan