N T M ( Nontuberculous Mycobacteria )

1. N T M(Nontuberculous Mycobacteria) 분자유전학 김 정 연 2005. 11. 9

2. NTM is… -과거 비정형 마이코박테리아(atypical mycobacteria), MOTT(mycobacteriaother tuberculosis)등으로 불리우다 최근 NTM(Nontuberculousmycobacteria)로 지칭 -토양과 하천 등 자연환경에 정상적으로 널리 분하고 있어 오염균 또는 집락균으로 간주 -1980년 대 이후 미국과 유럽,일본에서 후천성 면역겹핍증 등 면역기능 저하환자에서의 파종성감염과 기저질환이 없는 정상면역상태인 성인에서 NTM폐질환의 발생의 증가로 관심

3. Runyon 분류법 • Rate of growth -Slow growing > 7 days -Rapid growing < 7 days • Color and appearance of colonies -Photochromogen -Scotochromogen -Nonchromogen

4. Type of four

5. NTM 감염증

6. 항산균 도말양성 객담에서 NTM 비율(한국) ※항산균 도말양성 객담과 환자에서 NTM의 분리배율

7. NTM비율의 시기별 변화 ※시기별 변화에 따른 도말양성 객담에서 NTM 분리비율

8. NTM의 분리비율 항산균 도말양성 객담에서 NTM의 분리비율 결핵유병율이 높은 국가에서는 대부분 결핵균에 의해 발생 • 호주 : 43.2% • 미국 : 1.7% → 24.8% → 48.5% • 국내의 경우 : 80년대초 2-3% → 90년대 (15~30%)

9. NTM species Identification NTM의 객담도말검사 ● 결핵균과 비결핵성 마이코박테리아를 구별할 수 없음 PCR을 이용하여 감별할 것을 권고 NTM의 균명동정 ● DNA probes ● Sequencing NTM 폐 질환의 원인균 ● MAC(M.avium complex) : 60~80% ● M.kansasii :15~5% ● M.abscessus, M.fortuitum ,M.chelonae등 5%↓

10. Table 1. Classification of NTM recovered from human

11. NTM 검사의 의의 • 폐질환,림프염절염,피부질환,파종성 질환등 결핵과 유사한 증상 • 열,몸무게감소,기침,의욕상실,식은땀,객담등 • 면역력이 약화된 환자이거나 유아의 경우,비병원성균에 의해 유사결핵증이 종종 발생할 수 있고 그치료법도 다르기 때문에 결핵균과 비결핵균의 정확한 진단이 요구된다.

12. NTM&MTB PCR KIT • 16SrRNA부위의 internal transcribed spacer(ITS)부분을 타겟으로 하는 Nested PCR방법 • 1차 증폭과정에서는 타겟부위에서 마이코박테리움이 공통적으로 가진부위를 증폭(498bp) • 2차증폭과정에서는 1차증폭산물 중에서 병원성 결핵균 특이적인 부위를 증폭(134bp) • MTB검출에 일반적으로 사용되는 IS6110과는 다른 16SrRNA부위의 ITS를 사용하기 때문에 IS6110부위에 돌연변이가 발생하여 MTB PCR kit에서 증폭되지 않은 경우에도 MTB(Mycobacteriatuberculosis)를 진단할 수 있다

13. (객담,기관지세척액,체액) 검체의 전처리과정 • 2~4N NaOH를 첨가 끈적임을 풀어준다 • 검체0.5~1.5ml를 1.5ml tube에 옮겨 담는다. • 13,000rpm에서 5분간 원심분리 한 후 상층액을 제거한다. • 침전물에 1ml의 증류수를 넣어 vertex로 10초간 mix한다. • 3번 과정을 반복한 후1XPBS를 1ml첨가하여 vortex로 10초간 mix한다. • 13,000rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거한후침전물을 DNA추출에 이용한다.

14. (파라핀 조직) 검체의 전처리과정 1.파라핀 조직절편 10-15 장을 1.5ml tube에 옮겨 담는다. 2.1XPBS를 1.0ml첨가하여 75℃에서 파라핀을 녹인다. 3.13,000rpm에서 5분간 원심분리한 후 파라핀과 상층액을 제거한다. 4. 침전물에 1ml의 증류수를 넣어 vortex로 10초간 mix 5. 3번 과정을 반복한 후1XPBS를 1ml첨가하여 vortex로 10초간 mix한다. 6. 13,000rpm에서 2분간 원심분리하여 상층액을 제거 한 후 침전물을 DNA추출에 이용한다.

15. DNA 추출과정 1.전처리된검체에 DNA추출용 Resin을 50㎕를 넣어준다. 2.56℃ water bath에서 15분간방치한다. 3.100℃ heating block에서 8~10분간 끊여준후 vortex 에서 충분히 mix 해 준다. 4.-20℃ 냉장에서 3분간 식혀준후 vortex 에서 충분히 mix해준다. 5.13,000rpm 5분간 원심분리후 상층액을 PCR에 이용한다. ( PCR과정에 바로 사용하지않을 경우 Resin을 제거한 DNA만을 -20℃에서 보관한다.)

16. NTM&MTB PCR test Nested PCR Use 4.5 ul of DNA Sensitivity  Specificity  Use 1.5 ul of 1st PCR product

17. NTM&MTB 1차 498 bp 2차 134 bp MTB 1차 256 bp 2차 141 bp NTM&MTB PCR result NTM&MTB 1차 498 bp 2차 134 bp MTB 1차 256 bp 2차141bp