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Benoit GRELIER Hela KOUADA Laureline MAHE Fanny MARTICKE

Benoit GRELIER Hela KOUADA Laureline MAHE Fanny MARTICKE. Régulation de la fonction rénale. Projet créatinine. 1. PLAN. I- Le projet II- Démarche expérimentale : les réactions III- Etalonnage électrochimique. 2. I-Le projet. 3. 1) Le projet. La créatinine. La sueur. Le sang.

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Presentation Transcript

  1. Benoit GRELIER Hela KOUADA Laureline MAHE Fanny MARTICKE Régulation de la fonction rénale Projet créatinine 1

  2. PLAN I- Le projet II- Démarche expérimentale : les réactions III- Etalonnage électrochimique 2

  3. I-Le projet 3

  4. 1) Le projet La créatinine La sueur Le sang Où ? Le dosage de la créatinine permet l’évaluation de la fonction rénale REIN La salive Les urines produit de dégradation du phosphate de créatine dans le muscle. 4

  5. 1) Le projet Le dosage Insuffisance = 600 – 700 µmol/L ± 20 % Prises de sang régulière Le dosage sanguin A jeun / sans effort physique Taux normal = 65 – 120 µmol/L ± 20 % (homme) 50 – 100 µmol/L ± 20 % (femme) 5

  6. I- Le projet Actuellement 3 millions de personnes 60 % de séniors Insuffisance rénale 25 % de diabétiques Nécessite du personnel médical Sanguin Invasive Inconvénient du dosage Source d’infection / douleur 6

  7. I- Le projet Notre but • Utilisation simple • Utilisation simple • Dosage par Électrochimie • Sueur ? • Salive ? • Fiable à ± 10 % • Fiable à ± 10 % • Méthode non invasive • Miniaturisation • Miniaturisation 7

  8. 1) Le projet Définir plus précisément les objectifs/ les contraintes du projet Etablir le cahier des charges Se rendre compte de la réalité du projet Déroulement… Recherches… Recherches préliminaires Rencontre avec le P. JAOUI Rencontre avec le P. ZAOUI Achat des réactifs Salive Expériences au CIME Expériences au CIME 8

  9. II-LES REACTIONS 9

  10. II- Les réactions Est-ce que ca marche? Objectif : savoir si les réactions qui mènent à H202 fonctionnent ? 3 réactions 10

  11. II- Les réactions De la créatinine à H 2O2 créatinine + H2O créatine (1) créatininase créatine + H2O sarcosine (2) créatinase sarcosine + H2O H2O2 (3) sarcosine oxidase 11

  12. II- Les réactions Détection du H2O2 • peroxydase • H2O2 + 2* TMB TMBox+ (bleu) • peroxydase • H2O2(en excès)+ 2* TMB TMBox++ (rouge) • Il faudra obtenir du TMBox+ bleu car il varie linéairement en fonction de la H2O2 et donc de la sarcosine • => Avoir une quantité raisonable de H2O2 de l’ordre du µmol • La péroxydase doit être aussi en faibles quantité 1µL

  13. II- Les réactions La troisième réaction • 7 puits • Différentes quantités de sarcosine oxydase •  la meilleure obtenue pour 1/ 2 µL • vérification du bon fonctionnement du contrôle négatif … • A priori tout marche bien, mais …

  14. II- Les réactions Mais… • Les résultats sont très aléatoires: en variant les concentrations de sarcosine ou de sarcosine oxydase la réaction ne fonctionne plus ou fonctionne trop…?? • On n’arrive pas à contrôler la réaction • génant pour la détection

  15. II- Les réactionsc La deuxième réaction créatine + H2O créatine-amidinohydrolase sarcosine + urée (créatinase) Propriétés de l’enzyme : - Transforme 1μmol de créatine / minute - Enzyme à diluer à 2,0-3,0 U/mol Solution de créatinase (μL) Tableau croisé avec concentration=3 U/mol Solution de sarcosine (μL) Solution de sarcosine (μL) Sarcosine : 50 μL à 1,53 U/mol Créatine : 50 μL à 3 U/mol 15

  16. II- Les réactions La première réaction • On prépare la solution de créatinine 1.49g/100mL • Différentes concentrations de créatininase :0..80 µl dans les puits en ajoutant le reste des enzymes conservées au frigo •  La réaction ne marche pas 

  17. II- Les réactions Conclusion • Problème de conservation des enzymes à -20°C et à 4°C • Incompatibilité des solutions tampon pour les différentes enzymes  réactions perturbées (sachant que la 2ème réaction a bien marché avec 2 tampons différents • Changement de pH après la 1ère réaction  inhibation des autres

  18. III- Etalonnage électrochimique 18

  19. III- Etalonnage Principe Anode H2O2-> O2 + 2H+ + 2e- Potentiostat A - Cathode 2H+ + 2e- -> H2 V + REF CE WE I Gamme: 50 -> 300 mM EDTA/Tris Hcl +H2O2 Palier de diffusion Le courant détecté est proportionnel à la concentration en H2O2

  20. III- Etalonnage CE: ITO 1ère cellule électrochimique ER Ag,AgCl Balayage: 20 mV/s 500pts mesure pH=8 WE: Au Pas d’oxydation de H2O2 et ITO non inerte

  21. III- Etalonnage ER Ag,AgCl WE: Pt CE: Pt 2ème cellule électrochimique V=450 mV FAUX! Balayage: 20mV/s pH=8 / Ag,AgCl • Ampérométrie réalisée au mauvais potentiel • Concentration des ions • non constante (tampon dilué!) • =>Réfléchir avant d’agir!! Courant capacitif ou autre réaction

  22. III- Etalonnage WE: Au CE: Pt CE: Pt 3ème cellule électrochimique Balayage: 20mV/s pH=8 Oxydation de H2O2 ER Ag,AgCl V=450 mV 650 / Ag,AgCl • Problèmes possibles: • Cinétique H+ • Capacité tampon • Fuites • Mauvaise connection

  23. Conclusion générale • Réactions 2 & 3 vérifiées => Réaction 1 à vérifier • Echec courbe étalon: Montage, cinétique H+, • capacité tampon • Frustration : pas de dosage de la créatinine • dans de la salive • Perspectives : Cinétique H+ sur Pt (pH=8) • => CE plus grande? • Vérifier si on dépasse la capacité tampon • Expérience de la recherche

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