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Fundamentos de los Análisis Inmunoradioquímicos (AIRQ)

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Presentation Transcript

  1. Fundamentos de los Análisis Inmunoradioquímicos(AIRQ) Dra. Patricia Oliver Área Radiofarmacia CIN - Facultad de Ciencias

  2. Análisis basados en reacción Ag-Ac o ligando-receptor Clasificación REACTIVO ESPECIFICO TRAZADORAnticuerpo Receptor RadionucleidoRIA RRA IRMA EnzimaEIA ERA CromógenoLIA Quimioluminiscencia QIA

  3. Análisis inmunoradioquímicos Técnicas analíticas cuantitativas o semicuantitativasde amplia aplicación en medicina, veterinaria, así como en I&D. Son utilizadas para dosificar o detectar sustancias (analitos) presentes en pequeñas concentraciones en distintos fluídos biológicos u otras muestras.

  4. Análisis inmunoradioquímicos Tipos RIA Radioinmunoanálisis Ac + Ag + Ag* Ac-Ag + Ac-Ag* + Ag + Ag* IRMA Análisis inmunoradiométrico FS-Ac + Ag + Ac’* FS-Ac-Ag-Ac’* RRA Análisis de radio-receptor R + L + L* R-L + R-L* + L + L*

  5. RIA Método en el que el analito (Ag no marcado) presente en cantidad variable y el radiotrazador (Ag* marcado) presente en cantidad fija compiten por los sitios de unión del anticuerpo que se halla en cantidad limitada

  6. RIA Ag + Ac  AgAc Ag + Ac  AgAc + Ag Ag*+ Ac  Ag*Ac + Ag* Respuesta inversamente proporcional a [Ag]

  7. RIA de digoxinaCurva estándar

  8. RIAEquilibrio antígeno- anticuerpo

  9. RIAEl antígeno marcado compite con el antígeno frío por su unión al anticuerpo limitado

  10. RIAAusencia de antígeno da la unión máxima

  11. RIAUnión no específica del trazador al medio de reacción

  12. Ventajas del RIA Alta especificidad Alta sensibilidad 10-9 - 10-12g Manipulación sencilla Detección simple Volumen muestra 10-100 mL

  13. Desventajas del RIA Posibilidad de reacción cruzada Pérdida de inmunoreactividad por daño por marcación

  14. Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación

  15. Trazador Pureza elevada Inmunoreactividad Actividad específica alta Radionucleidos 125I, 3H

  16. 125I T1/2 60 días Eg 35 keV Eff conteo 70 %

  17. 125I-Ag Desventajas Modificación química para esteroides Estabilidad no mayor de 60 d Precauciones por radiación g

  18. 125I-Ag Métodos de marcación Cloramina-T Lactoperoxidasa Bolton-Hunter Iodogen

  19. Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación

  20. Anticuerpo Determina Sensibilidad Especificidad Precisión

  21. Anticuerpo

  22. Anticuerpo Características Título Afinidad Reacción cruzada

  23. Título Dilución del anticuerpo que se satura con el 50% del trazador Dilución óptima: es la que da la mejor relación entre estándar alto, medio y bajo

  24. Afinidad k1 Ag + Ac  AgAc k2 v1= k1[Ag] [Ac] v2= k2[AgAc] En el equilibrio v1= v2 entonces Ka=k1/k2= [AgAc]/[Ag] [Ac] Ka~ 1010 - 1013 M-1

  25. Especificidad 1. Progesterona 2. 17b Estradiol 3. Pregnanodiol 4. Cortisol 5. 11-deoxicortisol 6. Testosterona 7. Pregnenolona 8. Corticosterona 9. 17a-OH-progesterona 10. 11-OH-progesterona 11. 11-deoxicorticosterona 12. 5b-pregnan-3,20-diona 13. 11a-OH-progesterona 14. 5a-pregnan-3,20-diona

  26. Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación

  27. Estándar • Niveles de concentración del analito exactamente conocidos • Matriz análoga a las muestras • Procesamiento idéntico a las muestras problema • Determina la exactitud del RIA

  28. Obtención del estándar • Síntesis • Extracción a partir de órganos o tejidos • Ingeniería genética • Calibración con estándares de referencia internacional

  29. Requerimientos del estándar • Identidad con el analito • Reproducibilidad • Estabilidad • Pureza elevada • Especie molecular única o libre de interferencias

  30. Componentes Trazador Anticuerpo Estándar Separación

  31. Método de separación Rápido Sencillo Económico Reproducible No alterar equilibrio

  32. Clasificación Adsorción Precipitación Fase sólida

  33. Adsorción Carbón activado (Norit A) Carbón - dextrano Resinas intercambio iónico Silicatos Medición de AgAc en el sobrenadante

  34. Precipitación 2º Anticuerpo (antigamaglobulina) Sulfato de amonio Solventes orgánicos (EtOH, PEG) TCA Proteína A Medición de AgAc en el precipitado

  35. Fase sólida El anticuerpo o ligando está unido a un polímero insoluble No requieren centrifugación Esferas de sephadex o látex Partículas magnéticas Discos de celulosa Pared del tubo

  36. Procesamiento de datos Gráficos Métodos de ajuste

  37. Representaciones gráficas

  38. Métodos de ajuste Interpolación lineal y = a+bx Interpolación spline y = a+bx+cx2+dx3 Regresión lineal y = a+bx Regresión polinomial y = a+bx+cx2+dx3 Ecuación logísticay = (a-d) + d 1+(x/c)b y = (a-d) + d [1+(x/c)b]m y=respuesta, a=Bo, b=pendiente, c=ED50, d=NSB, x= conc., m=factor de asimetría

  39. IRMA Relación directa entre la concentración del analito a cuantificar y la respuesta del sistema analítico.

  40. IRMA Actividad unida a la fase sólida es la fracción unida del sistema. Actividad unida al complejo representa la relación directa con la concentración del analito a cuantificar.

  41. IRMA Anticuerpos monoclonales Introducción de plásticos con propiedades adherentes de inmunoglobulinas o moléculas grandes

  42. IRMATécnica Sandwich

  43. IRMATécnica Sandwich

  44. IRMATécnica Sandwich

  45. IRMATécnica Sandwich

  46. IRMATécnica Sandwich

  47. IRMATécnica Sandwich

  48. IRMA Comparación con RIA Unión de todo el analito presente Sensibilidad teóricamente infinita Especificidad: analito reconocido por dos paratopos Reproducibilidad (tecnología en fase sólida) ~ al RIA Limitación en el caso de moléculas pequeñas que pueden no disponer de diferentes paratopos que puedan ser reconocidos por diferentes anticuerpos

  49. IRMA El empleo de exceso de anticuerpo acelera las reacciones y se alcanza el equilibrio en menos tiempo

  50. Control de calidad Credibilidad al sistema analítico Credibilidad de cada etapa involucrada directa o indirectamente con el sistema analítico Proceso por el cual el laboratorio observa sus propios análisis