PCR 技术介绍 Introduction to PCR Technology

1. PCR技术介绍Introduction to PCR Technology 济南艾迪康医学检验中心有限公司 PCR实验室 杨超

2. 主要内容 一. DNA结构和复制 二. PCR 1. PCR发展简史 2. PCR基本概念 3. PCR原理 三. 荧光定量PCR检测HBV 1. 荧光定量PCR原理 2. 荧光定量PCR工作流程 3. 荧光定量PCR结果分析 4. 荧光定量PCR应用 四.基因芯片技术平台 ——HPV23亚型检测技术

3. DNA结构和复制 ——DNA结构

5. O- O- 5′ 5′ O=P— O=P— O—CH2 O—CH2 C T O O O- O- 3′ 3′ OH OH H H O 5′ O=P— O—CH2 C O O- 3′ OH H 碱基 A：腺嘌呤 G：鸟嘌呤 C：胞嘧啶 T：胸腺嘧啶 核糖 磷酸

6. DNA结构和复制 ——细胞内DNA复制

8. 1.DNA双链的打开 2.引物酶合成RNA引物

9. 3.DNA聚合酶 延长子链

10. 聚合酶链反应的发明 • 1985年，美国PE-Cetus公司的Mullis等人发明了聚合酶链反应（PCR） • 基本原理是在试管中模拟细胞内的DNA复制 • 最初采用E-coli DNA聚合酶进行PCR，由于该酶不耐热，使这一过程耗时，费力，且易出错 • 耐热DNA聚合酶的应用使得PCR能高效率的进行，随后PE-Cetus公司推出了第一台PCR自动化热循环仪 • 1993年，Mullis等因此项技术获诺贝尔化学奖

11. PCR ——基本概念 聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction)简称ＰＣＲ，是一项在短时间内大量扩增特定的ＤＮＡ片段的分子生物学技术。

12. PCR 基本原理 基本组成： 模 板 底 物 DNA聚合酶 引 物 缓冲液 Mg2+ 基本过程： 变 性 退 火（复性） 延伸

14. 模板DNA

15. 95℃ 55℃ 72℃ Taq酶 引物2 引物1 Taq酶

16. 第1轮结束 第2轮开始

18. DNA模板 DNA引物 TaqDNA聚合酶 dNTP 缓冲液 Mg2+

19. MJ Research, Inc. PTC-100 PTC-150 PTC-200 PTC-220 PTC-225

20. ABS, Inc. PE-2400 PE-2700 PE-9600 PE-9700

21. 循环参数 循环参数是指PCR循环中每一步骤的温度、时间以及循环次数 1．变性温度和时间 2. 退火温度和时间 3. 延伸温度和时间 4. 循环数

22. 1 2 3 高温变性 低温退火 适温延伸 94 温度 （℃） 72 55 22 1 2 3 4 5 时间（min） PCR反应基本过程 重复1~3步 25~30轮 DNA变性 形成2条单链 目的DNA片段 扩增100万倍以上 子链延伸 DNA加倍 DNA单链 与引物复性 DNA双螺旋

23. 平台期效应

24. 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。 荧光定量PCR (Real-time PCR) 所谓实时荧光定量PCR技术，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

25. 荧光定量PCR标记技术 1. TaqMan探针技术 2. LightCycler 双探针技术 3. 其他

26. TaqMan探针技术

28. LightCycler 双探针技术

30. 标本的采集 荧 光 定 量 P C R 工 作 流 程 标本的运送 标本的处理 基因扩增 扩增产物分析

31. 标本的采集 • 标本采集时间对扩增检测结果的影响 • 标本采集部位的准备 • 标本采集的类型和采集量 • 采样质量的评价 • 采样及运输容器 • 标本采集中的防污染

32. 标本采集时间对扩增检测结果的影响 在疾病发展过程中，标本采集过早或过晚都可能会给出假阴性结果

33. 标本采集部位的准备 标本采集部位的清洁消毒可去掉污染的微生物或其他杂物，但应适度，过度的清洁消毒有可能会去掉或破坏靶微生物，故标本采集部位的准备应由训练有素的人员进行。

34. 标本采集的类型和采集量 标本的类型和采集量应根据所测病原体而定 HBV 血清或EDTA抗凝血浆200ul TB 痰液 HPV CT 宫颈或尿道分泌物

35. 采样质量的评价 主要观察有无溶血，脂浊，异物等现象

36. 采样及运输容器 标本的采集材料如棉签、注射器应为一次性使用 运输容器亦应为密闭的一次性装置 采集标本所用的防腐剂、抗凝剂及相关材料不应对核酸扩增及检测过程造成干扰 严禁使用肝素抗凝

37. 标本采集中的防污染 标本采集最好用一次性材料，不用处理便可直接使用 采集中要特别注意污染，防止混入操作者的头发、表皮细胞、痰液等 如使用玻璃器皿，必须经250°C干烤4小时或用DEPC水处理，以使可能存在RNAase失活

38. 标本的稳定化处理 • 用于DNA检测的标本，采集后一般不需要特殊的稳定化处理，但标本应及时送至实验室 • 用于RNA检测的标本，由于RNA易受RNA酶的降解，因此在采集标本时，可将标本材料如血清或血浆按1:4的比例加至含有5mol/L GITC（异硫氰酸胍盐）的试管中，从而使血清(浆)中的RNA酶不可逆失活。经上述稳定化处理后，标本一般不需要冷藏即可运送。

39. 标本的运输 • 标本采集后必须尽快送至实验室 • 经过适当稳定化处理的标本可在常温下运送（如 • 用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血标本及用于 • RNA 扩增检测的经GITC稳定化处理的标本）通 • 常在运送时应采用不易破碎的容器装载标本 • 用于RNA检测的标本，如果未经稳定化处理，则 • 必须速冻后，放在干冰中运送

40. 标本的保存 • 临床体液标本如血清/血浆等可于-70℃下长时间贮存 • 用于DNA测定的已纯化核酸样本可在10mmol/L Tris， • 1 mmol/L EDTA缓冲液(pH 7.5-8.0)中4℃保存 • 用于RNA测定的已纯化核酸样本应在缓冲液中-80℃ • 或液氮中贮存；用乙醇沉淀的核酸样本贮存在-20℃ • 即可；用GITC处理的RNA标本在室温可保存7天

41. 实验室分区管理平面图

42. 试剂准备区（Ⅰ 区） • 使用所有试剂都已经准备好备用的商品试剂盒 时还需要试剂准备区吗？ • 试剂准备区的仪器设备主要有冰箱、超净台、 加样器、混匀器和离心机等。仪器除了要专用 外，还应有定期校准。 • 试剂的分装应在超净台中进行。

43. 标本处理区（Ⅱ 区） • 标本处理区内的生物安全柜、加样器、离心机、 恒温金属 浴、混匀器等设备都应使用次氯酸钠溶 液消毒，然后用蒸 馏水或70%乙醇洗涤去除残留的次氯酸钠 • 标本处理需在生物安全柜内进行，防止标本气溶胶的扩散 • 在标本处理的全过程中都应戴一次性手套，并经常更换， 以避免因手套的污染导致的标本间的交叉污染 • 实验时所用的加样器吸头都必须带有滤塞，以防止气溶胶 对加样器的污染

44. 基因扩增检测区（Ⅲ区） 空白对照 阴性对照 弱阳性对照 标准品（四种不同浓度） 质控品 待测样本

45. 结果分析

50. 结果判断(HBV) • 检测样本中1.0× 103copies/ml≤ HBV DNA ≤4.2 × 109copies/ml，测定结果有效，可直接报告拷贝数。 • 2. 检测样本中HBVDNA> 4.2 ×109copies/ml，既直接报告为> 4.2 ×109copies/ml。 • 样本检测结果< 1.0 × 103copies/ml，拷贝数仅供参考，报告为< 1.0 × copies/ml • 报告模式： 6.666E+06＝6.666 ×106 copies/ml