Spectrophotometers

1. Spectrophotometers Absorption spectrophotometer Visible and UV spectrophotometer Atomic absorption spectrophotometer Emission photometer Fluorometer Reflectometer Turbidimeter and nepleometer ชนิดขององค์ประกอบและหน้าที่ขององค์ประกอบต่างๆ Beer and Lambert’s Law การตรวจเช็คเบื้องต้น เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

2. Electromagnetic energy or wave เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

3. เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

4. Visible Spectrum Approximate Wavelength Color of light Absorbed Color of solution ( nm ) 400-435 Violet Green-yellow 435-500 Blue Yellow 500-570 Green Red 570-600 Yellow Blue 600-630 Orange Green-blue 630-700 Red Green เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

5. Incident Light [ Io ] Transmitted Light [ It ] A = 2 - log %T เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

6. b b b b A C a A b a b = ความกว้าง หรือ ระยะทางที่แสงผ่าน( cm ) C = ความเข้มข้นของสารละลาย หรือ ความเข้มข้นของตัวถูกละลาย ( g%) *ตัวทำละลายไม่ดูดกลืนคลื่นแสง Incident Light [ I0 ] Transmitted Light [ It ] C มากขึ้น,b คงที่ b มากขึ้น, Cคงที่ A = a b C Beer and Lambert’s Law ===> เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

7. e molar absorptivity ใช้สัญญลักษณ์เป็น A = a b C Beer and Lambert’s Law ===> a = absorptivity coefficient (สัมประสิทธิ์การดูดกลืนแสง) ถ้า C มีหน่วยเป็น mole/L หน่วยของ molar absorptivity คือ L.mol-1.cm-1 เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

8. Entrance Slit Amplifier & Display device Grating 0.852 Energy Lamp Mirror Photodetector Monochromator Cuvette Exit Slit • Interference filters • Prism • Grating องค์ประกอบของ Spectrophotometer / Photometer เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

9. Single beam spectrophotometer Double beam spectrophotometer Beam Splitter or Half-mirror Split beam spectrophotometer เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

10. VIS spectrophotometer UV spectrophotometer UV/VIS spectrophotometer ชนิดของหลอดให้พลังงาน(Energy lamp) Tungsten filament lamp : 320 - 2500 nm Hydrogen/Deuterium lamp : 160 - 275 nm Tungsten-halogen lamp : Xenon arc lamp : เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

11. เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

12. ชนิดของ monochromater Interference filters MgF2 Glass Glass Reinforced wave Wave not Reinforced เคลือบด้วย Silver เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

13. 200 500 800 3rd-order spectrum Refraction Grating 2nd-order spectrum 1st-order spectrum Exit slit Reverse-order spectrum Entrance slit White Light Spectrum pattern (linear scale) เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

14. 200 500 800 Near Infrareds light (NIR) NIR Near UV light Near UV Corn type prism Littrow type prism Glass prism spectrum pattern (log scale) 350 400 800 Quartz prism spectrum pattern (log scale) 200 250 300 800 Grating spectrum pattern (linear scale) เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

15. Band pass is that range of wavelengths that pass through the exit slit of the wavelength selecting device. Nominal band pass(width) and half-band pass(width) 100% peak height Radiant Energy Intensity 50% peak height half-band pass Band pass l1 l0 l2 Wavelength, nm เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

16. เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

17. เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

18. วัสดุที่ใช้ทำ cuvette Simple glass Special glass Plastic Quartz Flow-cell cuvette เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

19. ชนิดของ photodetector • Photocell or Barrier layer cell or Photovoltaic cell • Phototube • Photomultiplier tube • Photodiode • Phototransistor • Photodiode array เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

20. Photocell or Barrier layer cell or Photovoltaic cell Glass window Silver lacquer Semiconductor ( selenium, cadmium ) Metal base(iron) -Selenium type ตอบสนองต่อแสงช่วง 380-700 ทท, ไวต่อแสงช่วง 500-600 nm -ผลิตกระแสงได้ 10-100 mA -ไม่เหมาะกับ spectrophotometer ที่มี bandpass แคบๆ -ถ้าถูกแสงนานๆ จะผลิตกระแสงได้น้อยลง เรียกว่า fatigue เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

21. Phototube Glass envelope Photo cathode Anode Base 90 volt - + จ่ายกระแสงไฟฟ้าจนเกิด dark current 90 volt Photosensitive material ที่ใช้ได้แก่ cesium-antimony 352-625 nm cesium oxide 600-1000 nm multialkaline ( Sb / K / Na / Cs ) ผลิตกระแสได้น้อย ต้องมีภาคขยายสัญญาณไฟฟ้า, มีความไวกว่า photocell, ถูกแสงนานๆ เกิด fatigue ได้, อายุการใช้งานสั้นกว่า photocell เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

22. Gas-filled phototube Photomultiplier tube : PMT เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

23. P N N P N P N Photodiode P N P N N P N P P N N Photodiode array Phototransistor เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

24. A = a b C กรณีที่การดูดกลืนแสงของสารไม่เป็นไปตาม Beer’s Law 1. Very elevated concentrations are measured. 2. Incident radiant energy is not monochromatic. 3. The solvent absorption is significant compared to the solute absorbance. 4. Radiant energy is transmitted by other mechanisms(stray light). 5. The sides of the cell are not parallel. 6. The absorbance of a fluorescent solution is measured. เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

25. Absorbency Stray light 0% Stray light 1 % Stray light 5 % Linearity เมื่อมี 1% Stray light Linearity เมื่อมี 5% Stray light Concentration เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

26. Wavelength calibration การปรับความถูกต้องของความยาวคลื่นแสง Entrance Slit Grating Amplifier & Display device 0.852 Energy Lamp Mirror 630 nm Photodetector Monochromator Cuvette เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

27. Holmium oxide Potassium dichromate solution Peak(nm) 0.004 g/L in 0.5 N KOH 241.5 + 0.2 279.4 + 0.3 287.5 + 0.35 333.7 + 0.55 360.9 + 0.75 418.4 + 1.1 453.2 + 1.4 536.2 + 2.3 637.2 + 3.8 Peak=> 374+4 nm Cobalt chloride solution 4.4 g/L in 1% HCl Peak=> 512+5 nm Oxyhemoglobin solution Red cell in 0.05% NH4OH Peak=> 540+4 nm 576+4 nm Didymium filter : Peak => 585 nm เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

28. Absorbance accuracy การตรวจสอบความถูกต้องของการดูดกลืนแสง Potassium dichromate solution 120 mg/L in 0.01 N H2SO4 257 nm => 1.738+0.03 Abs. 357 nm => 1.288+0.02 Abs. Copper sulfate solution 4 g% in 1%H2SO4 650 nm => 0.448 Abs. Cobalt sulfate solution 510 nm => 0.48 Abs. 4 g% CoSO4.(HN4)2SO4.6H2O in 1%H2SO4 Neutral density filters เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

29. Absorbance linearity การตรวจสอบความเป็นเส้นตรงของค่าการดูดกลืนแสง Copper sulfate solution in 1%H2SO4 0, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 g% Potassium dichromate solution in 0.5 N KOH เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

30. Stray light checking การตรวจสอบแสงรบกวน Stray light filterมีคุณสมบัติดูดกลืนคลื่นแสงได้หมด => 0 %T หรือ ตัวเลข Abs. กระพริบ NaI 10g/l 220 nm NaNO250 g/l 340 nm K2Cr2O70.25 g/l in 0.05 N KOH 370 nm K2Cr2O70.50 g/l in 0.05 N KOH 400 nm CuSO4350 g/l 680 nm * Stray light ไม่ควรเกิน 1%T เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

31. Reflectance spectrophotometer เครื่องวัดความเข้มแสงสะท้อนจากผิวของสาร Filter or Wavelength Selector Collimating len or Slit Slit Test surface Light Source Collimating Len or Slit Readout device Detector เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

32. Reflection density (DR) = Log ( RO / Rtest ) RO = Intensity of light reflected by standard reflector Barium sulface-coated surface Rtest = Intensity of light reflected by test sample Transmittion density / Absorption / Opitical density A = log ( 1 / T ) orA = log ( Io / It ) เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

33. Kubelka-Munk-Theory The theory works best for optically thick materials where >50% of light is reflected and <20% of light is transmitted. dX Backing Reflectance iT I0 iR IR x X Paper Reflectance R is the absolute reflectance of sampled layer k is the molar absorption coefficient of the sample surface s is the scattering coefficient of the sample surface เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

34. Compounds ( A+ Cl- ) Combustion process heat สามารถดูดกลืน hv Ground state A+vapor + e- ------> Aovapor hv High temperature heat A*vapor Oxide Excited state ( unstable ) Oxygen Vaporized atoms in the group state (Ao ) absorb light at very narrowly defined wavelengths. [ 0.001 - 0.01 nm ] เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

35. Atomic absorption spectrophotometer Monochromator Line spectrum light Readout device Photomultiplier tube Hollow-cathode lamp Burner Chopper Sample solution Basic components of Atomic absorption spectrophotometer Burner Nebulization= convert solution to a fine spray or aerosol Atomization = convert chemicals to atomic vapor เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

36. Energy lamp for Atomic absorption spectrophotometer Specific metal salt Specific metal Electrical coil Inert gas Inert gas 200-400 Volt 200-400 Volt Hollow cathode lamp Electrodes Discharge Lamp (EDL) เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

37. Type of burner Total consumption burner Premix burner ( laminar-flow burner ) Burner head Flow spoiler retaining screw Burner head locking ring Pressure relief vents Oxidant Fuel gas Nebulizer adjusting knob Flow spoiler Nebulizer Nebulizer oxidant Sample capillary To waste เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

38. Flame atomic absorption spectrophotometer Temperature up to 2,300o C Flameless atomic absorption spectrophotometer Hydride generated atomic absorption spectrophotometer Monochromator Line spectrum light Readout device Photomultiplier tube Cell Hollow-cathode lamp HgH2 Sample solution Chopper Hydride generator Carrier gas เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

39. Graphite furnace atomic absorption spectrophotometer Platform or tube made form carbon Sample solution apply to Monochromator Line spectrum light Readout device Photomultiplier tube Hollow-cathode lamp Chopper High Voltage apply ( temperature up to 2,700o C ) เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

40. Emission interference Ao + heat ---------------------> A* 80% 20% hv Monochromator Line spectrum light Readout device Photomultiplier tube Hollow-cathode lamp Burner Chopper Sample solution เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

41. Flame photometer or Flame emission photometer วัดความเข้มของ emission light จากอะตอม เช่น ใช้วัด Na / K / Ca Emission light Wavelength selector( filters) Readout device Photomultiplier tube Burner Sample solution เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

42. Direct type and Internal standard type of flame photometer filters Coincident device Readout device burner detectors Sample and standard are diluted with a constant concentration of internal standard Internal standard : lithium or cesium เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

43. Light Transmitted No loss of energy Scattered No change of energy same wavelength before and after it interacts with the matter Absorbed Energy loss Some energy loss and Reemitted light Fluorescence and Phosphorescence Fluorometry วัดความเข้มของแสงที่เปล่งจากสารหลังจากกระตุ้นด้วยคลื่นแสง เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

44. Basic components of fluorometer First monochromator Excitation slit Sample in cuvette Emission slit Light source Second monochromator Detector Readout device เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

45. Chemiluminescence Luminol (5-amino 2,3-dihydro-1,4-phthalazinedione) peroxidase 400 - 450 nm hv Low intensity Oxidized Luminol Enhancer เช่น Luciferin ( 6-hydroxybenzothiazole ) จะทำให้ Intensity ของ emitted light มากขึ้น Luminometerเครื่องวัดความเข้มของ chemiluminesence light เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

46. Sample Cuvette Slit Light source = 15-90 Collimating len q Filter Stray light traps Signal Detector Basic components of nephelometer Particle diameters of Antigen-antibodies complex : 250 - 1,500 nm ความยาวคลื่นที่ใช้วัด => 320 - 650 nm เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)

47. Interaction of light with particles Reflected Light Transmitted Scattered Absorbed Detection of scattered light Detects the reduction in the light transmission caused by particle formation, and its quantifies the residual light transmitted. Turbidity Detects a portion of light that is scattered at a variety of angles. Nephelometry เครื่องวัดความเข้มแสง (วิสุทธิ์ กังวานตระกูล)