biyoteknolojide kullan lan y ntemler n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler PowerPoint Presentation
Download Presentation
Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 81

Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler - PowerPoint PPT Presentation


  • 435 Views
  • Uploaded on

Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler. Protein Saflaştırmada Yapılan İşlemler. Hücrelerin Parçalanması. T ekrarlı dondurma ve eritme ( Örn : Sıvı azot) Sonikasyon (Ultrason), Mekanik Parçalama (Blender) Organik çözücülerle hücre zarının geçirgenleştirilmesi Deterjanlarla muamele.

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Biyoteknolojide Kullanılan Yöntemler' - ferris-wheeler


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
h crelerin par alanmas
Hücrelerin Parçalanması
  • Tekrarlı dondurma ve eritme (Örn: Sıvı azot)
  • Sonikasyon (Ultrason),
  • Mekanik Parçalama (Blender)
  • Organik çözücülerle hücre zarının geçirgenleştirilmesi
  • Deterjanlarla muamele
ultrasonla par alama
Ultrasonla Parçalama

Ultrason ile zayıflamak mümkün mü?

kt rme ile k smi safla t rma
Çöktürme ile kısmi saflaştırma
  • Amonyum sülfat çöktürmesi
  • İzoelektrik çöktürme
  • Organik çözücülerle çöktürme
  • Asit ile çöktürme
  • Isı yoluyla çöktürme
  • Triton X-100 veya CHAPS ile membran proteinleri sökülebilir. SDS proteinleri denatüre ettiği için bu amaç için kullanılmaz.
santif j
Santifüj
  • Santrifüj ile karışımda asılı kalan maddelerin daha hızlı çökmesi salanır.
  • Ultra santrifüj kullanılarak mitekondriler bile çöktürülebilir.
slide8
Diferansiyel santrifüjleme. Homojenat, gittikçe artan santrifüj kuvvetine maruz bırakılarak fraksiyonlara ayrılır.
diyaliz
Diyaliz
  • Protein saflaştırmasının çeşitli aşamalarında proteinlerin küçük moleküllerden ayrıştırılması için kullanılan bir işlemdir. Örneğin, amonyum sülfat ile çökeltmenin ardından kullanılacak bir iyon değişim kromatografisi (bkz. aşağıdaki bilgili bölüm) adımı için bu tuzun giderilmesi gerekir, bunun için diyaliz yapılır.
diyaliz1
Diyaliz
  • Diyalizde, yarı geçirgen bir membran kullanılır, porlu bir selüloz membran gibi. Porların büyüklüğü proteinlerin geçmesine izin vermez ama küçük moleküller ve tuz iyonları geçebilir.
diyaliz2
Diyaliz
  • Diyaliz edilecek protein karışımı bir dializ torbasına konur, torba da büyük hacimli bir tampon çözeltisi içine yerleştirilir. Birkaç saat sonra torbanın dışındaki ve içindeki çözelti dengelenir, iki taraf küçük moleküller bakımından aynı bileşime sahip olur.
kromatografik y ntemler
Kromatografik Yöntemler
  • Protein Saflaştırılmasında genellikle kolon kromatografisi kullanılır. Bunlar:
    • Afinitekromatografisi
    • İyon değişim kromatografisi
    • Jel filtrasyonkromatografisi
slide18

Kromatografi, bir karışımdaki maddelerin bir sabit faz üzerinde farklı hızlarda sürüklenmesi sonucunda birbirinden ayrılması temeline dayanır.

  • Maddeleri sürükleyen ise bir sıvı ya da gaz olabilir
slide19

Karışımdaki maddeler sabit faz tarafından ne kadar alıkonuyorsa o oranda yavaş ilerler.

  • Örneğin; sıkışık bir trafikte taksiler durmuş iken motosikletlerin daha hızlı ilerlemesi gibi…
  • Ya da trafik kontrolünde taşıtlar durdurulurken yayaların ilerlemesi gibi…
uygulama ekline g re
Uygulama Şekline Göre
  • İnce Tabaka Kromatografisi
  • Kolon Kromatografisi

Sabit faz, saflaştırılmak istenen maddenin cinsine göre değişir. Bu sabit fazı genellikle hem ince tabaka hem de kolon kromatografisine uygulayabiliriz. Tercih size kalmış.

slide22
Sabit Faz

Başlangıç

Hareketli Faz

slide23

s

o

l

v

e

n

t

f

r

o

n

t

o

r

i

g

i

n

s

o

l

v

e

n

t

f

r

o

n

t

Less polar!

c

o

m

p

o

n

e

n

t

B

s

o

l

v

e

n

t

f

r

o

n

t

c

o

m

p

o

n

e

n

t

B

More polar!

c

o

m

p

o

n

e

n

t

A

c

o

m

p

o

n

e

n

t

A

mixture

o

r

i

g

i

n

o

r

i

g

i

n

slide25

Elinizdeki karışımda, şüphelendiğiniz maddenin olup olmadığını İTK ile anlayabilirsiniz.

Ayrılan noktayı kazıyıp maddeyi saf olarak da elde edebilirsiniz.

slide35

Kolon kromatografisi uygulanan tekniğe göre değişik alt bölümlere ayrılabilir.

    • İyon değişim kolonu
    • Jel filtrasyon kolonu
    • Afinite kolonu
    • Hidrofobik etkileşme kolonu
yon de i im kromatografisi
İyon Değişim Kromatografisi

Kolondaki sabit faz çalışılan pH’da + ya da – bir yüke sahiptir. Sabit fazla zıt yükle yüklü olan maddeler kolonda alıkonurken aynı yükte olanlar alıkonmazlar.

jel filtrasyon kromatografisi
Jel FiltrasyonKromatografisi

ŞOK! ŞOK! ŞOK!

Daha büyük moleküller daha hızlı ilerler.

af inite kroma
Afinite Kroma..

Specific interactions

afinite kromatografisi
AfiniteKromatografisi

Sabit faza öyle bir molekül tutturulur ki; sadece ilgilendiğimiz molekülle etkileşir ve onu kolonda tutar.

slide42

Kromatografi bir çok analiz cihazının kullandığı saflaştırma tekniğidir. Bunlardan sıklıkla kullanılan ikisi:

    • HPLC
    • Gaz Kromatografisi
slide43

Çözücüler

Pompa

Enjektör

Kolon

Dedektör

HPLC

Hewlett-PackardSeries 1100 HPLC

slide46

HPLC

HPLC Chromatogram of Standard 1

0.500 x 10-4 M caffeine

slide47

HPLC

HPLC Chromatogram of Standard 2

1.00 x 10-4 M caffeine

elektroforez

Elektroforez

1D elektroforez

Doğal elektroforez (Poliakrilamid, Agar)

SDS-PAGE (Sodyum Dodesil Sülfat PoliakrilAmid Jel Elktroforezi)

2D elektroforez

yatay elektroforez n kleer materyalleri ay rmada kullan lmaktad r
Yatay Elektroforez Nükleer Materyalleri Ayırmada Kullanılmaktadır

Yatay elektroforezde jel olarak agar kullanılır

dna zolasyonu
DNA İzolasyonu

Malzemeler

1. Lizis solüsyonu

0.5 M Tris-HClpH 8.0,

20 mM EDTA

10 mMNaCl

1% SDS

0.5 mg/mLproteinase K

2. Doygun NaCl (6M)

3. Etanol (%96, %70)

dna zolasyonu uygulama basamaklar
DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları
  • Hazırlanan lizis solüsyonundan hücre peletinin üzerine 2 mL eklenir. 37°C ‘de bir gece bekletilir.
  • 1 mL doygun NaCL eklenir.
  • Örnekler 55°C 10 dakika bekletilir.
  • 30 dakika 500 g’de santrifüj edilir.
  • Alttaki protein bölümüne dokunmadan süpernatant yeni bir tüpe aktarılır.
  • Süpernatantın2 katı hacimde soğuk %96’lık etanol eklenir. Tüp defalarca alt üst edilerek DNA’nın çökmesi sağlanır.
dna zolasyonu uygulama basamaklar1
DNA İzolasyonu Uygulama Basamakları
  • Çöken DNA plastik spatula yada santrifüj ile alınarak yeni bir tüpe aktarılır.
  • Santrifüj yapılacak ise 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.
  • %70’lik alkol ile DNA bir kez yıkanır. Bunun için 1mL %70’lik alkol eklenir. Tüp alt üst edilir. 10.000 g’de 10 dakika santrifüj edilir. Üstteki alkol fazı atılır.
  • DNA havada kurutulur.
  • Distilesuda DNA çözülür. Çözülmesini kolaylaştırmak için 65 0C’de 10 dakika tutulur.
  • Elde edilen DNA dan 1/25 -1/40 dilüsyon hazırlanır. A280 / A260 oranı ölçülür (oran >1.5 olmalıdır). 280 nm’dekiabsorbans önce 50, sonra da dilüsyon faktörü ile çarpılır. Sonuç μg/mL olarak DNA konsantrasyonunu verir.
enzyme linked immunosorbent assay elisa
Enzyme-linkedimmunosorbentassay (ELISA)
  • Antijen-antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. Antijene karşı antikor ya da antikora karşı antijen aramak mümkündür. Virüs ve parazit enfeksiyonlarında kullanılan bir tanı yöntemidir.