第五章醫藥生物技術

第五章醫藥生物技術 • 5-1 人類基因體計畫 • 5-2 基因治療 • 5-3 免疫作用 • 5-4 幹細胞 • 5-5 組織工程 • 5-6 製藥與生物技術 • 5-7 藥物基因體學 • 5-8 中草藥

人類基因體計劃 Human Genome Project (HGP) 約翰薩爾斯頓 John E. Sulston (影片: HGP.mpg)

重要發現 • 100兆細胞、30億鹼基對 • 97% 功能不明(?) • 1.1%表現序列(exons)外顯子 • 24% 內含子(introns) • 75%基因序列沒有實際作用或功能未知 • 人與人差異< 0.1%（？ >0.5%） • 與黑猩猩相同性 98.8% • 基因總數 2.0-2.5萬

人類基因數一

人類基因數二

人類基因數三

人類基因圖譜的繪製 • 遺傳圖譜(genetic map)：基因連鎖圖譜 • 發生基因重組機率大小 • 基因相對位置圖譜 • 單位centimorgan (cM) • 基因距離愈遠重組機率愈高，近機率低 • 物理圖譜(physical map) • DNA上限制酶的位置 • 染色體限制片段的順序 • 單位Mb (mega base pair) Kb • cDNA 基因在染色體上的位置

人類染色體圖譜一 參考資料：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/

人類染色體圖譜二 參考資料：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genome/guide/human/

5-2 基因治療 • 將一外來DNA送入細胞內，藉以治療基因缺陷或突變所引起的疾病 1990 NIH 腺苷脫氨酶 (ADA, adenosine deaminase )基因(deoxyinosine與deoxyadenosine沒有辦法代謝成inosine與adenosine，而累積的adenosine將會造成T細胞失去功能，進而喪失身體細胞免疫的作用) ↓ +反轉錄病毒 ↓ T 淋巴球 ↓ 送回體內體外In vitro 活體In vivo體內生合成denovo

基因治療常用的方法 • 病毒載體-危險性、效率高 • 反轉錄病毒: RNA → DNA 插入宿主染色體(隨機)，產生變異或造成不具功能 • 腺病毒: 同源基因重組、問題-產生發炎反應 • 腺病毒關聯載體：限制-轉殖基因有限 • 皰疹病毒：缺點-病毒本身太複雜 • 非病毒載體-安全性高、效率差 • 物理方式: 基因槍導入法、電穿孔法、直接將DNA打入肌肉(DNA疫苗) • 化學方式:微脂粒導入法(表現皆短暫性)、磷酸鈣沉澱法(利用細胞的胞飲作用)

基因治療標的細胞的種類 • 體細胞基因治療法 • 僅修正體細胞 • 對生殖細胞沒有影響 • 生殖細胞基因療法 • 除了修正體細胞 • 影響生殖細胞可遺傳

基因治療的應用範圍 • 癌症治療 • 使用免疫調控基因：細胞激素基因送入癌細胞→癌症疫苗→疫苗打入動物體→誘發宿主的免疫系統辨識癌細胞 • 送入自殺基因-配合藥物作用 • 引入抑癌或細胞凋亡基因使用抗血管生成因子：利用反義(anti-sense)RNA (p53gene.mpg) • 感染性疾病治療 • 送入感染處抑制病原菌基因表現 • 遺傳疾病治療 • 技術限制-單一基因疾病 • 心臟血管疾病治療 • 利用某些自殺基因消除增生的血管細胞 (影片: tga.mpg)

基因治療所遭遇的困難 • 基因嵌入細胞的效率不佳，反轉錄病毒外，其它不盡理想 • 基因能否表現? 基因重組導致癌症的發生

癌症的形成原因 • 癌症形成的原因相當的複雜 • 細胞核基因的異常是導致癌症發生的基本原因 • 在人體細胞中，所有謂的致癌基因(oncogen)和抑癌基因(tumor suppressor gene)。致癌基因或是抑癌基因的缺損或是變異容易導致癌症的發生(影片: cancer.mpg) • 癌症發生的相關危險因子 • 遺傳 • 家族性大腸息肉症(Familial polyposis syndrome) （大腸癌） • 母親或是姊妹有乳癌患者，則罹患乳癌的比率也會大為提高 • 放射線 • 核爆生還者罹患血癌的比例大為提高 • 放射線碘容易引起甲狀腺癌

病毒感染 • B型、C型肝炎病毒帶原者較常人易引起肝癌 • Epstein-Barr病毒易引起Burkitt氏淋巴瘤(Burkitt´s lymphoma) • 人類乳突病毒(Human papilloma virus)易引起子宮頸癌 • HTLV-1人類T 細胞白血球第一型病毒感染者有一小部份會發生T細胞淋巴瘤 • (細菌感染)胃中特殊的幽門桿菌(Helicobacter pylori)和淋巴瘤 (MALToma) • 化學或藥物刺激 • 黃麴毒素易引起肝癌 • 石綿易引起肺癌和間皮瘤(mesothelioma) • 芳香族化合物和膀胱癌的關係也曾被報告過

激素刺激 • 長期動情激素(estrogen)的刺激是子宮內膜癌和乳癌的危險因子之一 • 所以初經早、停經晚、和未生育小孩的婦女，其動情激素的刺激較久，發生子宮內膜癌和乳癌的機會較高 • 飲食因素 • 多食用青菜水果纖維素等已被證實有效降低癌症的發生率 • 飲食中過多脂肪容易肥胖，而肥胖容易導致脂溶性致癌毒性物質囤積在身體中有較高的致癌機會 • 過多的醃製食物，其致癌物質，如亞硝胺類等，也會增加，因而提高致癌的機會

行為因素 • 不良的行為，如抽煙、喝酒等，會增加肺癌和食道癌的發生機會 • 多重性伴侶及危險性性行為等，會增加感染人類乳突病毒的機會，因而增加子宮頸癌的發生率

96年國內十大死因 • 惡性腫瘤占28.9% • 心臟疾病占9.3% • 腦血管疾病占9.2% • 糖尿病占7.3% • 事故傷害占5.1% • 肺炎占4.2% • 慢性肝病及肝硬化占3.7% • 腎炎、腎徵候群及腎性病變占3.7% • 自殺占2.8% • 高血壓性疾病占1.4%

男性前十大惡性腫瘤種類 • 肝癌、肺癌、結腸直腸癌、口腔癌、胃癌、食道癌、攝護腺癌、胰臟癌、非何杰金淋巴癌、鼻咽癌 • 女性前十大惡性腫瘤種類 • 肺癌、肝癌、結腸直腸癌、女性乳癌、胃癌、子宮頸癌、胰臟癌、非何杰金淋巴癌、膽囊癌、卵巢癌

基礎免疫觀念一 • 細胞免疫與體液免疫 • 細胞免疫: 胸腺細胞主導 • 殺手細胞: 直接辨識病原 • 輔助者細胞: 幫助B細胞產生抗體 • 體液免疫: B細胞主導(產生抗體的細胞) • 抗體可辨識抗原 • 主動免疫與被動免疫 • 主動免疫: 接觸抗原後自行產生免疫反應，產生記憶反應 • 被動免疫: 注射抗體所誘發

基礎免疫觀念二 • 非專一性免疫反應（先天免疫） • 反應介質 • 補體 • 發炎介質 • 殺菌物質 • 反應細胞 • 顆粒球（嗜中、酸、鹼性球） • 巨噬細胞 • 自然殺手細胞 • 肥大細胞 • 專一性免疫反應（後天免疫） • 反應介質 • 免疫球蛋白（抗體） • 細胞激素 • 細胞毒殺因子 • 反應細胞 • 抗原呈現細胞 • 輔助型T細胞 • 毒殺型T細胞 • B淋巴球

免疫細胞起源：淋巴系統與造血系統一

免疫細胞起源：淋巴系統與造血系統二 （曾哲明, 2006) (影片: immuno1.mpg) （影片: immuno.mpg）

嚴重急性呼吸道症候群(SARS) Severe Acute Respiratory Syndrome • 冠狀病毒 CORONAVIRUSES • 最適生長溫度 33-35℃ • 次易引發普通感冒的病毒 • 僅有兩株分離的人類病毒株 • 核酸：正股RNA、套膜、 80-160 nm • 演化分析歸類為第四類冠狀病毒 • 基因體 +RNA - 27,000-31,000 nt • 重症患者肺部嚴重纖維化、呼吸衰竭

冠狀病毒檢驗方法 • 反轉錄聚合酶連鎖反應（RT-PCR） • 將RNA反轉錄成DNA，再繼續將DNA數量放大 • 分離病毒→RT-PCR →定序比對 • 即時PCR檢測技術(Real-Time PCR) • 傳統PCR需要時間較久、解析度差、低正確性、低敏感度、無自動化、結果無法量化 • 利用螢光訊號，即時監測反應 • 免疫螢光抗體法(indirect fluorescent antibody test, IFA) • 測病人血清中有無病毒抗體

傳統 PCR 需要時間較久瓊膠解析度差（需差10倍）低正確性低敏感度無自動化只鑑別大小結果無法量化僅呈現PCR最後的結果 Real-TimePCR可改善上述的缺點

Real-time PCR

疫苗 • 微生物或其表面抗原製作成對抗此病原的物質 • 具專一性 • 可使免疫系統產生反應與記憶 • 為主動免疫 • 人類免疫缺乏病毒（HIV）會引以愛滋病 • 到目前無法製造出有效的疫苗 WHY? • 突變速率太快 • 多種躲避人體免疫系統偵測的策略 (影片: hiv.mpg)

單株抗體 • 抗體通常只與抗原上的一小段胺基酸結合 • 此小段胺基酸稱為抗原決定位(antigenic determinant) • 大分子量抗原-多抗原決定位(多價抗原) • 單一抗體 VS 抗原之抗原決定位-提高免疫效率 • 一種B細胞一種抗體，挑出所要之B細胞大量培養均質抗體稱為單株抗體(monoclonal antibody)

細胞融合技術 • 將不同的生物細胞染色體+細胞質融合雜交細胞 (融合瘤細胞hybridoma) 單株抗體+藥物 ↓ 癌細胞為抗原

單株抗體的製作流程 參考資料：http://www.thyroid-info.com/immune/14a.gif

幹細胞 (影片: stemcell.mpg) • 定義：一群尚未分化的細胞，可分化成特定組織 • 全能幹細胞：每個細胞均可發育成一完整生物體 • 多能幹細胞：可發育成特定組織如：血液幹細胞、神經幹細胞、皮膚幹細胞 • 來源: • 人類胚胎囊胚期的內細胞質團，稱人類胚胎幹細胞 • 胎兒的生殖組織培養(經捐贈者同意) (影片: differ.mpg)

幹細胞的應用一

幹細胞的應用二 • 2006瑞士科學家利用羊水中的幹細胞培育出心臟瓣膜 • 2007荷蘭科學家進行『細胞造肉』工程 • 肌胚細胞→加入養分→網片生長→肌肉纖維 • 無化學添加物、生長激素、抗生素 • 臍帶血 • 可發育成血液及免疫系統細胞 • 可恢復造血系統 (取代骨髓移植)

胚胎幹細胞 VS 倫理問題 • 胚胎 = 人 • 臍帶血幹細胞分化能力差 • 衛生署胚胎幹細胞研究倫理規範 • 胚胎幹細胞的來源限制 • 自然流產的胚胎組織 • 符合優生保健規定之人工流產的胚胎組織 • 人工生殖後得銷毀之胚胎(未滿14天) • 不得提供精卵（透過人工授精製造胚胎供研究用） • 細胞核轉殖術製造之胚胎再審議 • 無償提供，不得以複製人為研究目的 • 人體試驗研究-治療疾病與改善病情

複製的相關進展 • 複製技術 • 體細胞的細胞核經由體細胞核轉殖到卵母細胞而產生的囊胚 • 可發育出活的個體 • 可培養成胚胎幹細胞 • 暗示了卵母細胞的細胞質可能含有一些因子可以將轉殖後的體細胞核重新導引到具有多能性的狀態 • 2006年日本京都大學山中伸（Shinya Yamanaka) 教授將四種基因Oct4、Sox2、c-Myc、Klf4轉殖到老鼠已經分化的纖維母細胞 • 已分化的纖維組織母細胞重新設定變回幹細胞

組織工程 (影片: tissue.mpg) • 將特殊細胞培植在骨架上，重建特定的組織或器官。最早產品人工皮膚 • 主要市場：整形外科、傷口療護、心血管疾病 • 優點: • 用少量組織體外增殖 • 量身訂做器官原貌 • 易克服排斥問題 • 現況與未來 • 軟骨、血管、皮膚、神經組織……..人造手 • 結合基因工程和幹細胞技術

組織工程的要素 • 細胞 • 自體細胞、同種細胞、異種細胞、幹細胞、基因改造細胞 • 人工細胞外間質 • 可分解天然或合成高分子材料 • 多孔性結構 • 膠原蛋白、藻膠酸、幾丁質 • 合成聚合物-聚乳酸 • 生長訊息 • 需有傳達細胞貼附、增生、遷徙、分化的各種訊息因子 (影片: material.mpg)

已上市之重要組織工程產品一

已上市之重要組織工程產品二

人造皮膚一

人造皮膚二 參考資料：http://www.devicelink.com/mddi/archive/98/05/018.html Plainsboro, NJ

第五章醫藥生物技術