microRNA

1. microRNA

2. מה בתוכניתנו היום: • נתאר בקצרה את אופן היווצרות ופעולת miRNA. • נציג דוגמא מעניינת לרגולציה על ידי miR. • נסקור את הגישות באיתור אתרי מטרה בעזרת אמצעים חישוביים. • נתמקד באלגוריתם מסוים ובניסיון לבדוק בעזרתו את ההשפעות של קו-רגולציה של miRNA. • נציג ניסוי המשווה את דפוס הביטוי התאי לאחר החדרת miRNA.

3. אבל קודם כל סרט!

4. מה זה microRNA? • רצפים אנדוגניים של כ-22~ נוקליאוטידים של מולקולת RNA. • הרצפים מאופיינים בשמירות פילוגנטית. • עמדות 'גרעין' בד"כ בין נוקלאוטידים 2-9בקצה ה-'5 של ה-miR הכרחיות לפעילות ה-miR. • מאופיינים בקומפלימנטציה חלקית לאתרי המטרה שלהם. • לרצפים קשת רחבה של תפקידים רגולטוריים משמעותיים.

5. תופעות בהן נמצא ש-microRNA לוקח חלק: • שליטה בחלוקה התמיינות תאית, מוות תאי, ומטבוליזם של שומן בזבובים. • קביעת דפוסי נוירונים בנמטודות. • שליטה בתהליכי התמיינות של שושלות של תאים המטופואטים ביונקים. • שליטה בהתפתחות פרחים ועלים בצמחים. הערכות שמרניות על בסיס גישות חישוביות מצביעות שדוגמאות אלה מהוות חלק קטן ביותר מהסה"כ.

6. תהליך היווצרות miRNA:

7. אופן פעולת mircoRNA: miRNA פועל ככל הנראה בשתי צורות עיקריות: • עיכוב תרגום. • חיתוך של mRNA ודרגדציה.

8. מאגר ה-miRNA registry • על מנת לרכז את הרצפים הידועים, אתרי המטרה שלהם ולהקל על מתן שפה משותפת, הוקם מאגר ה-miRBase. • נכון לגירסה 8.1 ממאי 2006 במאגר 3963 רשומות.

9. מאמר סקירה:תפקידי microRNA בבעלי חיים Ambros Victor1. (2004) The function of animal microRNAs Nature431 350-355 1 Dartmouth Medical School, Department of Genetics, New Hampshire.

10. ASEL/ASER חלק ממערכת החישה של הנמטודה בנוימאסימטריה של צמד ניורונים כימו-סנסוריים: ASE left, ASE right צמד הנוירונים מזהה תרכובות שונות ובתאום מאפשר לתולעת להגיב אפקטיבית לגירויים. ספציפיות התנהגותית זו נגרמת כתוצאה מהבדלים בביטוי הגנטי בסוגי התאים השונים – ASEL/ASER. נמצא שההבדל העיקרי בין התאים הוא ביטוי של כימו-רצפטורים שונים:gcy-7 ב-ASEL וgcy-5 ב-ASER.

11. על ידי שימוש בשיטת סימון בפלורסנציה נמצאו תולעים מוטנטיות בהן חסרה האסימטריה הבילטראלית. בעזרת מוטנטים אלו נמצאו מספר גנים המקודדים לפקטורי שעתוק שונים cog-1,lim-6,ceh-36. בנוסף נמצא רצף מקודד נוסף שאינו מקודד חלבון אלה RNA היוצר את צורת ה-hairpin האופיינית ל-miRNA - lsy-6.

12. על ידי ניסוי של הסרה והוספת מקטעים נמצא האזור של הרצף ל-lsy-6. מדוע הצורך בתהליך סבוך כזה? לבסוף נמצא רצף שצפוי שיתקפל למבנה hairpin. מוטציה שפוגעת במבנה זה מנטרלת את פעילות lsy-6. מוטציה מפצה המחזירה את המבנה מחזריה את רמת הפעילות.

13. נמצא של-lsy-6 רצף עם התאמה חלקית לרצף משלים באזור ה-'3 UTR של cog-1. רצף ה-miR גורם להפחתת הביטוי של פקטור שעתוק זה.

14. צפי ואישוש של אתרי מטרה: • החפיפה החלקית בין miRNA לבין מטרה שלו ברצף mRNA מרמזת על הספקטרום הרחב של רצפים עליהם יכול miR מסוים לבצע רגולציה, ועל הפוטנציאל הרב הטמון במנגנון זה כמנגנון רגולטורי. • אותה חפיפה חלקית מהווה כמובן מכשול עיקרי לשימוש בכלים חישוביים לאיתור רצפי המטרה.

15. אפיון אתרי מטרה לרגולציית miRNA: גישות המחקר הרווחות כיום מתבססות על ההנחה שניתן לאפיין את המטרות ל-miRNA על פי הקריטריונים שנקבעו בחקר lin-4 ו- let-7 ואתרי המטרה הבדוקים שלהם. אפיון אתר מטרה להיקשרות miR: • מיקום אתר המשלים לרצף ה-miR בעיקר באזור ה-'3 UTR. • ריכוז של זיווג בסיסים, עפ"י ווטסון-קריק, רצוף בין ה-miR לאתר המטרה באזור 'גרעין' ב-'5 של רצף ה-miR. • שמירות פילוגנטית של אתרי המטרה ברצפי ה-UTR של גנים אורתולוגיים. יש לציין שבסה"כ קיימת כמות ראיות נכבדה המאששת ניסויית את 3 ההנחות לעיל.

16. סקירת התוצאות של קב' שונות: • הקבוצה של Stark ושות. דיווחה על 100 אתרי המטרה בעלי הניקוד הגבוה ביותר עבור כל אחד מ-73 רצפי ה-miR הידועים בזבוב. • הקבוצה של Enright ושות. דיווחה על 10 אתרי המטרה המשמעותיים ביותר סטטיסטית עבור כל רצף miR בזבוב.בסה"כ נמצאה חפיפה של 15% בין דיווחי שתי הקבוצות.

17. קבוצה שלישית התמקדה בבדיקת גנים המקודדים לחלבונים הידועים כקובעי דפוסי התפתחות עוברית בזבוב מצאה 39 אתרי מטרה אפשריים לרגולציה על ידי miRים. • מתוכם 20% נמצאו בניסוי של Stark אולם לא נמצא אפילו אחד בניסוי של Enright.

18. הסיבות להבדלים: למרות הגישות הדומות ביסודן לזיהוי אתרי מטרה, התוצאות המחקריות אינן מתלכדותהיטב. ככל הנראה בעיקר בשל ההבדלים הבאים: • הדרך להגדרת שמירות פילוגנטית. • הדרך הספציפית לאפיון אתרי קישור בהתבסס על האתרים המוכרים. • כיצד משוקללים גורמים סטטיסטים ותרמודינאמיים לדירוג וניקוד אתרי המטרה הצפויים.

19. מופעים כפולים של אתרי מטרה: • הקבוצה של Lewis הראתה שמספר מופעים שמורים רב עבור רצף מטרה אפשרי ל-miR מסוים באזור ה-UTR הוא פרדיקטור טוב לכך שאותו גן אכן מבוקר ע"י ה-miR. • מאידך גם הגברת הרגישות של אלגוריתמי החיפוש עבור אתרי קישור יחדניים חשובה. זאת מאחר וקיימות דוגמאות לבקרה על ידי miR שאינה דורשת מספר רב של אתרי קישור. למשל עבור lin-4 קיים רצף מטרה יחיד לגן lin-28 הידוע כרצף מטרה בדוק של miR זה.

20. דרכים לשיפור האלגוריתמים הקיימים: • קיים צורך לשלב באלגוריתמים לחיזוי אתרי קישור פרמטרים שיכילו את המבנה המרחבי של אתרי ה-'3 UTR.ניסוי מסוים שביצע שינויים בסביבת אתר הקישור הראה שהייתה לכך השפעה על קישור רצף ה-miR. • יש לבדוק גם רצפי '5 UTR על מנת לבחון את ההנחה לגבי חשיבותם של רצפי ה-'3 UTR. • רצפי miR בצמחים מזהים לעיתים קרובות רצפי מטרה באזורים מקודדים ולכן כדאי לבחון גם אזורים כאלה בבע"ח.

21. מגבלות משמעותיות באלגוריתמים הקיימים: • ההתבססות על שמירות פילוגנטית רחבה באפיון רצפי המטרה מצמצמת יכולת האלגוריתמים לזהות אתרי מטרה. • לראייה:לקבוצת הmiR-ים miR-290 – miR-295 המבוטאת ספציפית בתאי גזע עובריים בעכבר לא נמצאו עדין רצפים אורתולוגיים שמורים באדם. • פיתוח אלגוריתמים החוזים אתרי מטרה ל-miR גם במקרה וקיים אתר קישור בודד.

22. משמעות חוסר השימור הפילוגנטי: • נמצא שמספר מוגבל ביותר של מטרות עבור miR מסוים בחולייתנים שמור כמטרה בגן האורתולוגי בחרקים. • ניתן להסיק מכך שבעוד שהשמירות הריצפית של miRים היא גבוה יחסית גם במרחקים פילוגנטים גדולים הרי שמסלולי ומטרות הרגולציה יכולים להיות שונים.

23. שאלות פתוחות: • מה הגורמים המשפיעים על נגישות ופעילות miR ב-UTR מסוים? • מה הם הגורמים הקובעים האם רצף מסוים יעבור חיתוך ודגרגדציה או עיכוב תרגום? • באיזו מידה קיים שיתוף וקו-רגולציה בין miRים שונים על אותם גני מטרה?

24. זיהוי אתרי מטרה קומבינטורית Azra Krek1,2, Dominic Grun1, Matthew N Poy3et al. (2005) Combinatorial microRNA target predictions Nature Genetics 37 495-500 1 Center for Comparative Functional Genomics, Department of Biology, New York University. 2 Department of Physics, New York University. 3 Laboratory of Metabolic Diseases, The Rockefeller University.

25. מטרות הניסוי העיקריות המוצגות במאמר: • להציג אלגוריתם למציאת אתרי מטרה עבור רצפי miR. • לעמוד את מידת ההצלחה של האלגוריתם. • לבחון היפותזה שמתבצעת קו-רגולציה של גנים על ידי מספר miR שונים.

26. תאור האלגוריתם PicTar –Probalistic Identification of Combinations of Target Sites קלט: קבוצת חיפוש – קבוצה של רצפי miR שאת אתרי המטרה שלהם נחפש. מסגרת חיפוש – קבוצה של רצפים אורתולגויים מיושרים (multiple alignment). פלט: דירוג של הגנים ממסגרת החיפוש עפ"י ההסתברות שתת-קבוצה מסוימת מקבוצת החיפוש נקשרה לגן.

27. האלגוריתם – מציעת רצפי 'גרעין': נגדיר: רצף 'גרעין' עבור miR מוגדר כרצף בן 7 נוק' המתחיל במקום הראשון או השני מתחילת ה-miR ('5). רצף 'גרעין' לא מושלם הוא רצף בו אין התאמה מושלמת לאתר המטרה. בנוסף אינו מגדיל את האנרגיה החופשית בקשר 'גרעין':mRNA ואינו מכיל קשרי G:U. 1. שימוש בתוכנה nuclMap על מנת למצוא את כל רצפי ה'גרעין' בכל שיירי ה-UTR במסגרת החיפוש. 2. בדיקה האם רצף גרעין עבור miR מסוים נופל במיקום תואם עפ"י היישור עבור כל המינים בבדיקה. רצפי מטרה באתרי ה-UTR שעברו את שני המבחנים לעיל עוברים לשלב הבא.

28. האלגוריתם – מציעת רצפי עגינה: בשלב זה נבדק, בעזרת התוכנה RNAhybrid, שהאנרגיה החופשית של הרצף השלם microRNA:mRNA הינה מתחת לערך סף מסוים. ערך הסף לרצפי 'גרעין' מושלמים נקבע ל-33% מהאנרגיה החופשית האופטימאלית של רצף ה-miR המלא כשהוא קשור לרצף mRNA משלים. ערך הסף לרצפי 'גרעין' לא מושלמים נקבע ל-66% מהאנרגיה החופשית האופטימלית.

29. האלגוריתם - מציעת רצפי עגינה: רצפים שעוברים את מבחן אנרגית הסף נקראים רצפי עגינה ולוקחים חלק באלגוריתם. ניתן לסנן בשלב זה שיירי UTR שנתגלו בהם פחות מ-n אתרי עגינה.

30. האלגוריתם – קביעת ציון PicTar: האלגוריתם משתמש ב-Hidden Markov Models ובאלגוריתם של Baum-Welch על מנת לחשב ציון הסתברות מריבית שרצף RNA מסוים ('3 UTR) מהווה מטרה לקבוצה מסוימת של miRים. אינטואיטיבית – רצפי ה-miR מתחרים בינם לבין עצמם לבין הרקע על היקשרות לאתרי העגינה ברצף ה-RNA.

31. האלגוריתם – שילוב התוצאות לציון: אתר גרעין מושלם מקבל הסתברות pלהיות אתר מטרה (p  0.8). אתר שאינו מושלם מקבל הסתברות N/(1-p). N מספר אתרי המטרה שאינם מושלמים (בד"כ 2-20). הציון הסופי לרצף הוא log היחס בין הרצף עם ההסתברות המרבית כפי שנקבע ע"י השלב הקודם לבין הסתברות הרקע. כל שנשאר לעשות זה לסכום את ציוני ה-PicTar עבור כל אחד מהשיירים האורתולוגים לקבלת ציון סופי עבור כל גן במסגרת החיפוש.

32. מאפייני האלגוריתם: • האלגוריתם מחזיר ציון סינרגיסטי עבור קבצת miR.יש משמעות לחיפוש קבוצת miRים. • האלגוריתם מתייחס לחשיבות רצפי הגרעין ולחשיבות אנרגית הקישור של הרצף הכולל. • אורך הרצף נלקח בחשבון – רצף ארוך בעל n אתרי קישור יקבל ציון נמוך יותר מרצף קצר. • ניתן להשתמש בתוצאות ניסיוניות עתידיות לשיפור האלגוריתם. • לאלגוריתם זמן ריצה פולינומיאלי באורך הקלט – מצוין זמן ריצה של כ-15 דק' (על מחשב PC סטנדרטי עם GB2 זיכרון) כאשר מבצעים חיפוש עבור 1-6 miRים.

33. בדיקת ה-miRים lin-4let-7 ב-C.elegens ו-C.briggasae: • על מנת לבחון את יעילות האלגוריתם הריצו אותו על 10,607 רצפי '3 UTR של צמד הנמטודות הקרובות פילוגנטית עבור מטרות קישור ל-lin4 ו-let7. • מטרות הקישור הידועות ל-miRיםlin-28 ,daf-12 ,hbl-1 ,lin-14 דורגו במקומות ראשון, שני, רביעי ושביעי בהתאמה. • אתר הקישורlin-41 אף הוא מטרה בדוקה ניסויית ל-miRים לא נמצא על ידי האלגוריתם. • התוצאות מראות שלאלגוריתם רגישות וספציפיות גבוה יחסית.

34. בדיקת האלגוריתם בחולייתנים: • לצורך בדיקת האלגוריתם בחולייתנים החוקרים יצרו multiple alignments של 20,254 רצפי '3 UTR בעלי אנוטציה באדם לרצפים גנומיים ב-7 חולייתנים אחרים: שימפנזה, עכבר, חולדה, כלב, תרנגולת, pufferfish ו-zebrafish. • ישור הרצפים של היונקים כיסה 92% מרצפי האדם.כאשר נכללה גם התרנגולת 55%.כאשר נכללו כל 8 החולייתנים 21%.

35. הערכת Signal-to-noise: • לצורך הערכת כמות ה-false postives. נבדק מספר אתרי המטרה שזוהו עבור 58 רצפי miRים השמורים בין אדם עד לתרנגולת ומספר אתרי מטרה שזוהו עבור קבוצה בגודל זהה עם רצפים אקראיים מגודל מתאים. • היחס signal-to-noise הוא היחס בין מספר האתרים שזוהו עבור קבוצת ה-miRים לבין מספר האתרים שזוהו עבור הקבוצה האקראית. • התוצאות הובילו את החוקרים להערכה שלכל miR כ-200~ רצפי מטרה.

36. Signal-to-noise – המשך: • כאשר נבדק אותו יחס signal-to-noise עבור רצפים בהם נמצאו n אתרי מטרה ברצף ה-UTR נמצא שהיחס השתפר באופן משמעותי.

37. בבדיקה נוספת נבדקו מספר אתרי המטרהעבור 168 miRים עד כלב ו-116 miRים עד לתרנגולת.בגרף מוצגים מספר אתרי הקישור הממוצע ל-miR על מול ציון סף. • מעל הגרף יחס ה- Signal-to-noise המתאים.

38. בבדיקה נוספת נבדקו צירופים של ה-miRיםhsa-miR-141, hsa-miR-23a, hsa-miR-136 באותו אופן.שוב ניתן להבחין בשיפור בתוצאות.

39. בדיקה ניסויית של אתרי קישור: • בבדיקה באמצעותwestern blotting ו-luciferase reporter נבדק מדגם של 13 אתרי קישור צפויים עבור miR-375 ו- miR-124.בבדיקה אוששו 7 מ-13 האתרים על ידי אחת השיטות לפחות.

40. בדיקת הסתברות קומבינטורית: • על מנת לקבל הערכה גסה למספר ה-miRים המבקרים במשותף גן מטרה יחיד. החוקרים ספרו את מספר השלשות, מתוך קבוצה של 58 miRים, להן אתרי עגינה בתעתיק יחיד. • הגרף מציג את הסיכוי שעבור שלשה מסוימת ימצאו n תעתיקים שונים המכילים אתרי עגינה לשלשה עבור רצפי ה-miR ועבור קבוצת רצפים אקראית.

41. בדיקת רגולציה של שלשות על הגן Mtpn: • על מנת לבחון מקרה ביולוגי של קו-רגולציה של miRים בחרו החוקרים ב-3 ה-miRים הנפוצים ביותר בתאי לבלב בעכבר:124-miR 11.5% מסה"כ פרופיל ה-miRים בתא. 375-miR 6.5%miR-7b 6.5% • האלגוריתם הופעל על השלשה עם הדרישה שלפחות רצף עגינה אחד יהיה שמור מאדם ועד כלב עבור כל אחד מהmiRים. • התוצאות נבדקו עבור הימצאות של הגן Mtpn גן שידוע בכך שהוא עובר רגולציה על ידי 375-miR.

42. רגולציה על הגן Mtpn - תוצאות: • כשנבדקו 18,500~ רצפי יישור '3 UTR עבור אתר עגינה ל- 375-miR הגן ל-Mtpn דורג במקום 102. • בבדיקה עבור אתרי עגינה ל- 124-miR דורג Mtpn במקום 727. • שילוב בין 124-miR ו- 375-miR הקפיץ את הדירוג ל-14. • לבסוף חיפוש עבור אתרי עגינה לכל השלשה מיקם את Mtpn במקום ה-4 מבין האתרים שאותם האלגוריתם מחזיר כאתרים העוברים רגולציה על ידי הmiRים.

43. בדיקת פרדיקציות האלגוריתם: • תאי ניורובלסטומה מסוג N2A הודבקו ברצפים של siRNA ההומולוגיים ל-124-miR ול-7b-miR. • תוצאות ה-western blot המוצגות מראות כי לעומת רצפי הבקרה הרצפים ההומולוגיים גרמו להפחתה המשמעותית ביותר בביטוי.

44. בבדיקה נוספת נבדקה פעילות luciferase:לתאי N2A הוחדרו הרכבה של '3 UTR של Mtpn ו-Rr-luc, רצפי si-let-7, si-124, si-375 ו- si-GFP עם סוג נוסף של רפורטר Pp-luc כבקרה פנימית. • התרשים מציג את היחס בין שני הרפורטרים מנורמל כנגד פעילות si-GFP.

45. מסקנות וסיכום: • המאמר מציג למעשה גישה חישובית למציאת אתרי מטרה עבור miR יחיד או קבוצת miRים המבצעים קו-רגולציה של קבוצת גנים. • באמצעות שימוש ביישור רצפים (multiple alignments) המנצל את זמינות הגנום של 8 חולייתנים האלגוריתם מצליח לנבא מעל רמות רעש כ-200~ רצפי מטרה לכל miR. • השימוש באלגוריתם הביא לאישוש הניסויי של הגן הראשון הידוע העובר קו-רגולציה על ידי שלושה miRים שונים.

46. אנליזה של Microarray המראה הפחתת ביטוי של קבוצת גני מטרה Lee P. Lim1, Nelson C. Lau2et al. (2005) Microarray analysis shows that some microRNAs downregulate large numbers of target mRNAs Nature 433 769-773 1 Rosetta Inpharmatics (subsidiary of Merck and Co.), Seattle, Washington. 2 Whitehead Institute of Biomedical Research and Department of Biology, MIT, Cambridge, Massachusetts.

47. מטרות הניסוי העיקריות המוצגות במאמר : • לבחון שינויים בדפוס הביטוי התאי כתוצאה מביטוי רצף miR. • בחינת מנגנון הרגולציה של רצפי ה-miR.

48. מודל הניסוי: הניסוי התבצע בתאי HeLa - • זן תאים מסרטן צוואר הרחם מהחולה Henrietta Lacks שנפטרה בשנת 1951. • תאים בני אלמוות - לתאים ביטוי של האנזים טלומרז בשלב חלוקת התא ולכן אין התקצרות טלומרים. • מקור התאים הסרטניים בהדבקה מווירוס הפפילומה 18HPV. • לתאים מבנה גנומי שאינו זהה לגמרי לתאי אדם למשל לתאים 82 כרומוזומים (4 עותקים של כרומוזום 12, 3 עותקים של כרומוזומים 6,8,17)

49. מהלך הניסוי : בניסוי הודבקו תאי המודל בשני רצפי miRNA המתבטאים בעיקר ברקמות מסוימות. • miR-124 – רצף המתבטא בעיקר בתאי מוח. • miR-1 – רצף המתבטא בעיקר בתאי שריר ולב. מהתאים הופק mRNA והוכן פרופיל של הביטוי באמצעות microarrays. Figurefrom: Babak, T.et al. (2004) Probing microRNAs with microarrays: Tissue specificity and functional inference RNA10: 1813-1819

50. תוצאות: סינון תוצאות הביטוי לגנים שביטויים הופחת במידה משמעותית הניב את התוצאות המרתקות הבאות: miR-124 – נמצאו 174 גנים בעלי אנוטציה שהופחת ביטויים בתאים. miR-1 – נמצאו 96 גנים בעלי אנוטציה שהופחת ביטויים בתאים. דפוסי הביטוי שהופחתו תאמו את הרקמות בהן נפוץ ה-miR: miR-124 – לדפוס הביטוי החדש דמיון לביטוי בתאי מוח. miR-1 – לדפוס הביטוי החדש דמיון לביטוי בתאי שריר ולב.