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Identificação computacional de genes de microRNA

Identificação computacional de genes de microRNA. Alexandre dos Santos Cristino Bruno Augusto N. Travençolo César Beltrán Castañón Elza Helena Andrade Barbosa. Roteiro. Introdução Caracterização b iológica de miRNAs Predição computacional de miRNA de Drosophila

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Identificação computacional de genes de microRNA

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Presentation Transcript

  1. Identificação computacional de genes de microRNA Alexandre dos Santos Cristino Bruno Augusto N. Travençolo César Beltrán Castañón Elza Helena Andrade Barbosa

  2. Roteiro • Introdução • Caracterização biológica de miRNAs • Predição computacional de miRNA de Drosophila • Validação experimental dos candidatos à miRNA • Conclusões

  3. rRNA miRNA Interrupção miRNA Introdução

  4. Introdução

  5. Caracterização biológica de miRNAsO que é um microRNA (miRNA)? • Nova classe de pequenos RNAs reguladores, “escondidos” no genoma (regiões intergênica e intrônica ou “DNA lixo”) • Estes miRNA de 22 nucleotídeos foram descobertos em estudos de regulação do desenvolvimento de C. elegans (lin-4 e let-7) • Alguns com expressão constitutiva, e outros com controle de expressão temporal- e tecido-específica

  6. Caracterização biológica de miRNAs • Inicialmente transcrito como um pré-miRNA de 70-100 pb (stem loop, hairpin, double strand) • Pré-miRNA é processado pela Dicer (RNAase III) • Formação de miRNA “maduro” com 21-22 nt • Atua negativamente na regulação pós-transcricional pela formação de um duplex RNA, interrompendo a tradução de um RNAm pela região 3’-UTR • RNAi -> silenciamento gênico

  7. Dicer (RNAase III) Caracterização biológica de miRNAs miRNA Loop UGAGGUAGUAGGUUGUAUAGU (miRNA)

  8. Caracterização biológica de miRNAs • miRNA são altamente conservados em grupos filogenéticos afastados (insetos, peixe e humano)

  9. Predição computacional de miRNA de Drosophila • Regras e parâmetros foram derivados a partir de 24 sequências de miRNA de Drosophila • O alinhamento global (VISTA) entre os genomas de espécies diferentes de Drosophila mostraram alta conservação nas 24 sequências de miRNA referência.

  10. Predição computacional de miRNA de Drosophila • Alinhamento global D. melanogaster e D. pseudoobscura (VISTA plot)

  11. Predição computacional de miRNA de Drosophila • O alto grau de conservação e a formação de stem-loop não são características exclusivas dos miRNAs • Portanto, foram necessários critérios adicionais, tais como determinar padrões de divergência dos nucleotídeos entre os 24 pares ortólogos

  12. Predição computacional de miRNA de Drosophila Conservação total (3/24) Divergência nos braços (0/24) • Resultado do Alinhamento Divergência em um braço (0/24) diverge no loop (10/24) Divergência no braço >> divergência no loop (1/24) Divergência no loop  divergência em um braço (10/24)

  13. Predição computacional de miRNA de Drosophila • Observações do conjunto referência (24 miRNA) indicam que os miRNAs são filogeneticamente conservados e a estrutura stem-loop demostra um padrão característico de divervêngia dos nucleotídeos. • miRseeker: pipeline desenvolvido para localizar candidatos a miRNA no genoma • Dividido em três partes: 1. Identificar regiões conservadas; 2. Identificar e avaliação da qualidade de stem-loops; 3. Avaliar padrões de divergência

  14. Predição computacional de miRNA de Drosophila1. Identificar regiões conservadas

  15. Predição computacional de miRNA de Drosophila1. Identificar regiões conservadas - AVID AVID – Alinhamento Global D. Melanogaster 1287 contigs D. Pseudoobscura 18000 contigs Eliminar os genes anotados, tais como: exons, transpossons, snRNA, snoRNA, tRNA, rRNA Alinhamento total resultou em 51.3 de 90.2 MB de sequências intrônicas e intergênicas

  16. Predição computacional de miRNA de Drosophila1. Identificar regiões conservadas • Sem sobreposição e cruzamento • Prefere clean matches à repeated matches • Tamanhos maiores que a metade do maior match • Score baseado no tamanho e nos vizinhos

  17. Predição computacional de miRNA de Drosophila1. Identificar regiões conservadas AVID – Alinhamento Global D. Melanogaster 1287 contigs D. Pseudoobscura 18000 contigs Eliminar os genes anotados, tais como: exons, transpossons, snRNA, snoRNA, tRNA, rRNA Alinhamento total resultou em 51.3 de 90.2 MB de sequências intrônicas e intergênicas

  18. Predição computacional de miRNA de Drosophila1. Identificar regiões conservadas • Determinar uma região candidata a miRNA • Janela de 100 unidades (pares de nucleotídeos alinhados ou gap) avança no alinhamento • critério mínimo de conservação:  13% gaps e 15% mismatchs • critério satisfeifo -> sequência Dm/Dp guardada em arquivo multi-fasta -> janela avança 10 unidades • 436.000 regiões conservadas em sequências intrônicas e intergênica • 118.000 super-regiões (agrupamento de regiões que apresetaram sobreposição de 10 nt)

  19. Predição computacional de miRNA de Drosophila2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops

  20. Predição computacional de miRNA de Drosophila2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops • Análise de regiões conservadas com o algoritmo de dobramento de RNA (folding),mfold 3.1 • miRNA pode estar localizado em qualquer uma das fitas (forward e reverse), o pode interferir na qualidade do hairpin predito • 436.000x2 = 872.000 mfolds • cutoff -> mínimo de 23 pares de bases e energia livre de um braço G  -23.0 kcal/mol

  21. Predição computacional de miRNA de Drosophila2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops • Métricas para o helical score: • Premia nucleotídeos pareados em +1 • Penaliza cada loop simétricos de um nucleotídeo em –1 • Penaliza cada loop simétrico de dois nucleotídeos em –2 • Penaliza progressivamente loops simétricos com mais de três nucleotídeos, assim como bulbos e loops assimétricos • Maximiza o tamanho de steme minimiza o loop • Um score total foi calculado pela fórmula: (helical score +(ABS(G)/2))/2

  22. D. Pseudoobscura (Dp) D. Melanogaster (Dm) Predição computacional de miRNA de Drosophila2. Identificar e avaliar qualidade de stem-loops regiões com maior score de cada super-região melhores 25.000 super-regiões Dm miRNA candidato -> regiões pareadas com maior score dentro de cada super-região score médio de regiões pareadas Dm/Dp score total dos melhores 3 hits, rankeados com o score médio Dm/Dp WU-BLAST de seq. Dm contra seq. de Anopheles 21/24 membros do conjunto referência Dm, foram agrupados com os melhores 600 candidatos a miRNA

  23. Predição computacional de miRNA de Drosophila3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados

  24. Predição computacional de miRNA de Drosophila3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados • Aplicação de Filtros booleanos – Remoção de regiões com alto score e/ou alta conservação que não são candidatas à miRNA. • Trimagem da ponta fora do braço principal • Blocos conservados de pelo menos 22 nt • Estes blocos devem estar localizados a aproximadamente 10 nucleotídeos do loop final • Remoção das classes4, 5 e 6 • ~ 1/3 dos stem-loops conservados passaram pelos filtros • 18/24 (75%) sequências (conjunto referência) estavam entre os primeiros 124 candidatos

  25. Predição computacional de miRNA de Drosophila3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados

  26. Predição computacional de miRNA de Drosophila3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados • 570 passaram pelo filtro de conservação (barra verde) • 124 miRseeker candidatos: • conjunto referência (verde) • novos miRNA (azul) • miRNA conservados em uma terceira espécie (laranja)

  27. Predição computacional de miRNA de Drosophila3. Avaliar padrões de divergência em stem-loops conservados Top 600 (21/24) Após o filtro booleano: 200 (18/24) 42 novos candidatos em 200 melhores predições apresentaram conservação de sequência e estrutura em outras espécies (Anopheles e Apis)

  28. Validação experimental dos novos candidatos à miRNA • 24 novos miRNA foram validados por northern-blot de RNA total isolado de embriões, larvas/pupa e adulto de Drosophila

  29. Conclusão • miRseeker identificou com sucesso os genes de miRNA conhecidos em Drosophila • 32 novos miRNA foram identificados pelo miRseeker, sendo que 24 deles foram validados por northern blot • estima-se a presença de 110 genes de miRNA em Drosophila (1% dos genes codificantes, em concordância com vertebrados) • divergência dentro da região loop foi inesperada. Duas conclusões: • a região de loop parece ser menos crítica no pré-miRNA • deve haver uma pressão de seleção na sequência que forma a região stem, já que a Dicer atua na estrutura helicoidal (braço)

  30. Referências bibliográficas • Lai et al. (2003) Computacional identification of Drosophila microRNA genes. Genome Biology, 4(7):R42 • Ambros (2001) MicroRNAs: Tiny regulators with Great Potential. Cell, 107: 823-826 • Pasquinelli (2002) MicroRNAs: deviants no longer. TRENDS in Genetics 18(4):171-173 • Moss (2002) MicroRNAs: Hidden in the Genome. Current Biology 12:R138-R140 • Mount (2001) Bioinformatics. Sequence and Genome analysis. pp. 205-235 • Bray et al.(2003) AVID: A Global Alignment Program. Genoma Research 13:97-102

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