Tema: 12. Obtención y análisis de datos cinéticos.

1. Tema: 12. Obtención y análisis de datos cinéticos. 1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten: 1.1. Orden cero de reacción 1.2 . Orden uno de reacción 1.3. Orden mixto de reacción 2. Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten: 2.1. Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk. 2.2. Representación de Hanes 2.3. Representación de Eadie-Hofstee. 2.4. Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden

2. 1. Integración de la ecuación de Michaelis-Menten: Estudio de acuerdo con el orden de reacción Dependencia de la velocidad con respecto a la [S] 1.1. Orden cero de reacción S>>>Km 10 veces la Km Integrando entre So y St y entre 0 y t Permite comparar cantidades totales de enzima Vmax1= kcat [E01] Vmax2= kcat [E02] La razón de las cantidades de enzima es proporcional a la razón de velocidades máximas o de las actividades enzimáticas obtenidas experimentalmente Comparar cantidades de una misma enzima de un tejido o en circunstancias metabólicas diversas, diferenciación, patologías, etc

3. 1.2. Orden uno de reacción S<<<<Km A concentraciones 1/10 Km Integrando entre S0 y St Obtener el valor de Vmax/Km Conociendo cantidad incial de enzima [Eo] puede obtenerse la constante de especificidad (kcat/Km)

4. 1.3. Orden mixto de reacción S ≈ Km Vmax Dividiendo los dos términos por Km y por t Linearización de la ecuación integrada de M-M a S ≈ Km Estudiando el avance de una sola reacción cuando estamos en orden mixto se pueden obtener: Vmax y Km

5. Vmax v [S] 2.Linearización de la ecuación de Michaelis-Menten Lo primero es obtener los correspondientes parámetros cinéticos. Para obtener los parámetros cinéticos de una enzima lo que solemos hacer es obtener la velocidad inicial, v, a diferentes concentraciones deS. v frente a [S]

6. P Imaginemos que estamos estudiando una reacción S  P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados: [S] (mmol L-1) vo(mmol L-1 min-1) 0,30 0,57 0,50 0,85 0,75 1,18 1,50 1,82 3,00 2,50 7,50 3,23 A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación V  [S]. Calcúlenlo ahora y escriban sus resultados en la pizarra.

7. Analicen los datos. ¿Alguna conclusión? • Como acabamos de ver la representación de v frente a [S] es poco útil para estos fines, debido a: • la dificultad para dibujar con precisión una hipérbola rectangular • la dificultad para encontrar las asíntotas (Vmax), de manera correcta, y consecuentemente para calcular Km * Estas dificultades, fueron ya tenidas en cuenta por Michaelis y Menten, quienes intentaron representar v frente a log[S]. Esta representación tiene ciertas ventajas, aparte de su valor histórico, pero debido a su poco éxito, en la bioquímica moderna, no comentaremos nada más sobre ella.

8. Para resolver este problema, y poder calcular Vmax y Km con mayor fiabilidad, se han propuesto varios procedimientos o métodos. La mayoría de ellos basados en la linealización de la ecuación de Michaelis-Menten • Quizás las tres representaciones más usadas sean: • Representación de Linenweaver-Burk o de dobles inversos (1/v  1/[S]) • Representación de Hanes ([S]/v  [S]) • Representación de Eadie-Hofstee (v  v/[S]) Además de estas tres representaciones, basadas en la linealización de la ec. de M&M, existe una curta basada en la representación directa v  [S], o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden.

9. 2.1.Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk - Si escribimos la ecuación de Michaelis-Menten en su forma inversa, obtenemos: 1 1 Km 1 ---- = ------------- + ------------- --------- v Vmax Vmax [S] y = b + m x

10. 1/v m =Km/Vmax a - 1/Km 1/Vmax 1/[S] • Pendiente Km/Vmax • Corte en el eje-x  1/v =0 -1/Km • Corte en el eje-y 1/[S] =0 1/Vmax

11. La representación más utilizada, no es la más recomendable ya que da impresiones extremadamente engañosas de los errores experimentales: así para pequeños valores de v, pequeños errores en la medida de v, conducen a grandes errores en 1/v, mientras que para valores grandes de v los mismo pequeños errores en la medida de v conducen a errores apenas apreciables en 1/v. 1/v 1/[S])

12. 2.2. Representación de Hanes y = b + m x Si multiplicamos ambos miembros de la ec. de dobles inversos, por [S], obtendremos, La representación de [S]/v frente a [S], da una recta: - Esta representación se conoce como representación de Hanes, representación de Woolf o de Hanes-Woolf.

13. [S]/v Pendiente = 1/Vmax corta en el eje [S]/v en un punto = Km/Vmax, corta en el eje [S] en un punto = - Km m = tga = 1/Vmax a - Km Km/Vmax [S]

14. ¿Cómo afectarán los errores de medida de la velocidad de reacción en esta representación? [S]/v [S] * En esta representación, como puede verse en la siguiente figura, los errores en [S]/v son un reflejo mucho más fiel de los errores cometidos al medir el valor de v. Por este motivo, la representación de Hanes es preferible a otras linealizaciones de la ecuación de Michaelis-Menten.

15. Tarea 1 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S  P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados: [S] (mmol L-1) vo(mmol L-1 min-1) 0,30 0,57 0,50 0,85 0,75 1,18 1,50 1,82 3,00 2,50 7,50 3,23 A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación de Hanes.

16. y = b - m x 2.3.Representación de Eadie-Hofstee. Si multiplicamos ambos miembros de la ecuación de inversos por v * Vmax obtenemos, Vmax = v + (Km v)/[S] y reordenando Esta representación se conoce comorepresentación de Eadie-Hofstee

17. v Vmax m = tga = -Km a Vmax/Km v/[S] • La representación de v frente a v/[S] nos da una recta de: • pendiente = -Km • corte en el eje v = Vmax • corte en el eje v/[S] = Vmax/Km

18. v v/[S] Aspectos Positivos Esta representación en general proporciona resultados realmente buenos, ya que v aparece en ambas coordenadas como factor multiplicativo, por lo que los errores cometidos en la medida de v, harán que la curva se acerque o aleje del origen en lugar de hacerlo paralelamente al eje de ordenadas. Aspectos Negativos Esta representación, contrariamente a la de dobles inversos que hace aparecer como buenos malos resultados, hace aparecer como malos, buenos resultados, dificultando grandemente el ocultamiento de puntos que se desvíen de la recta. Por lo que esta representación es la más adecuada para el estudio de comportamientos que se desvíen del modelo de Michaelis-Menten.

19. Tarea 2 Imaginemos que estamos estudiando una reacción S  P catalizada por una enzima E, y que obtenemos los siguientes resultados: [S] (mmol L-1) vo(mmol L-1 min-1) 0,30 0,57 0,50 0,85 0,75 1,18 1,50 1,82 3,00 2,50 7,50 3,23 A partir de estos datos calcular Vmax y Km mediante la representación de Eadie-Hofstee.

20. 2.4.Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden Independientemente, en 1974: - J. Jiménez Vargas y J.M. Macarulla. Fisicoquímica Fisiológica, Interamericana (4ª Edición), Madrid, (1974) - R. Eisenthal y A. Cornish-Bowden. Biochem J., 139, 715-720, (1974) * Publicaron un procedimiento, totalmente diferente a los anteriores, para la obtención de Vmax y Km, conocido como representación lineal directa.

21. - La ecuación de M y M podemos transformarla en la ecuación canónica de una recta en la que tratamos a Vmax y Km como variables, y a [S] y v como constantes, Si r es la recta que pasa por los puntos (a, 0) y (0,b), la ecuación la podemos escribir Dividiendo por v(S) Reordenando,

22. Si el primer par de valores observados de v y [S] son v1 y [S1] y representamos la recta que definen: Vmax v1 Km -S1

23. Vmax v2 v1 -S2 -S1 Km Si tomamos ahora un segundo par de valores observados: v2 y (S2), ....

24. Y luego un tercer par: v3 y (S3), .... Vmax (Km, Vmax) v3 v2 v1 -S3 -S2 -S1 Km - Como podemos observar, las distintas rectas se cortan, intersecan, en un punto, común a todas ellas, de coordenadas (Km, Vmax).

25. NOTA: Experimentalmente, de manera general, no obtendremos un punto, si no un entorno de puntos, y la media de las coordenadas de estos puntos nos dará el valor medio de Km y Vmax con sus correspondientes desviaciones estándar. Vmax (Km, Vmax) v3 v2 v1 -S3 -S2 -S1 Km - El número máximo de puntos de corte vendrá dado por: [n(n-1)]/2, donde n es el número de rectas.

26. Tarea 3. Suponga que estamos estudiando una enzima E que cataliza la reacción S  P, y que obtenemos los siguientes datos experimentales: Concentración inicial Concentración de producto (mmol L-1)de sustrato (mmol L-1) a distintos tiempos (t = min) t=0 t=1 t=2 t=3 t=4 5,0 0 150 300 450 600 6,5 0 180 360 540 720 10,0 0 235 470 705 940 20,0 0 325 650 975 1300 40,0 0 410 820 1230 1640 Calcular Km y Vmax utilizando todos los procedimientos estudiados.

27. Resumen • Estudiada la ecuación de Michelis-Menten de acuerdo con el orden de reacción podemos encontrar las siguientes circunstancias- • A concentraciones saturantes de substrato nos encontramos en el orden cero de reacción • La comparación de actividades enzimáticas en ordén cero de reacción puede servir para comparar cantidades de una misma enzima en diferentes circunstancias metabólicas. • b) A concentraciones de substrato menores que un décimo de la constante de Michaelis, nos encontramos en orden uno de reacción. • c) A concentraciones de substrato del orden de la constante de Michaelis es posible obtener una ecuación a partir de la ecuación integrada de Michaelis-Menten permite determinar graficamente los parámetros dinéticosVmax y Km estudiando la curva del avance de una reacción con respecto al tiempo • La ecuación de Michaelis-Menten es una cónica, hipérbola que pasa por el centro de coordenadas v:S, cuya asintota paralela al eje de las abcisas representa la velocidad máxima. • Diferentes transformaciones algebráicas permiten la linealización de la ecuación de M-M para una determinación más fácil de los parámetros Vmax y Km. • Entre estas se encuentran: • Representación de dobles inversos o de Linenweaver-Burk. • Representación de Hanes • Representación de Eadie-Hofstee • Representación lineal directa o representación de Einsenthal y Cornish-Bowden