Serial Analysis of Gene Expression (SAGE)

1. Serial Analysis of Gene Expression(SAGE) Greice Andreotti De Molfetta, PhD

2. SAGE • Vantagens: Sistema aberto – todos os transcritos podem ser identificados; Acuracia na detecção dos transcritos; Banco de dados digital; Informação quantitativa e qualitativa; • Desvantagens: Caracterização de novos transcritos é computacionalmente complicada a partir de sequencias pequenas (tags); Especificidade da Tag (aumentou para 21 bp); Existência de transcritos que não contem o sítio da enzima NlaIII; Sensitividade baixa da detecçao de variantes de splicing alternativo;

3. CATG AAAAAAAAA CATG AAAAAAAAA AAAAAAAAA CATG TAGS • TAGS ou ETIQUETAS: • Seqüências pequenas mas exclusivas de um determinado gene. NÃO SE REPETEM EM OUTROS GENES 10 pares de bases Banco de dados grande e validado

4. TAGS • TAGS de 10 pb - identificam unicamente um transcrito; • TAGS ligados uns aos outros facilitam clonagem e seqüenciamento de todos os transcritos da amostra; • Análise: os tags são separados e identificados através de seus sítios de reconhecimento CATG; Velculescu et al, 1995

5. SAGE e Tags • Baseando-se na existência das tags e na sua identificação: • Análise em série ( Grande escala): • Identificação de um número maior de genes • Transcriptoma completo de um organismo • Custo e tempo menores • Quantificação da expressão gênica (contagem dos tags)

6. DITAGS • Localizado entre as sequências “CATG” • Ditags apresentam 20-26 pb entre cada sequencia “CATG” • Descartar os ditags duplicados - incluindo aqueles da fita reversa da PCR • Descartar as sequênicas “linker” • Contabilizar a ocorrencia de cada tag

7. Como é um resultado de SAGE?

8. SAGE 1- Obtenção do RNAm (poli-A); 2- Síntese do cDNA com o uso de oligo (dt) biotinilado; 3- Ligação do cDNA (cauda poliA) à partículas magnéticas revestidas com Streptavidina; 4- Clivagem com uma enzima de ancoragem (NlaIII) que reconheça 4 pb (CATG); 5- Ligação de adaptadores (contendo um sítio de reconhecimento para a enzima de etiquetagem, e sítios para os primers A e B) aos cDNAs; 6- Clivagem com a enzima de etiquetagem (TE) (BsmF1), uma enzima do tipo 2 que reconhece o sítio do Adaptador (adjacente ao cDNA) clivando aproximadamente 14 pares de bases adiante, liberando um tag específico para o cDNA; 7- Ligação dos tags para formação de ditags; 8- Amplificação dos ditags por PCR com os primers A e B; 9- Isolamento dos ditags utilizando a enzima de ancoragem para retirada dos adaptadores; 10- Recuperação dos ditags; 11- Formação dos concatâmeros pela ligação dos ditags; 12- Clonagem e seqüenciamento dos concatâmeros, que formam a biblioteca de SAGE.

9. SAGE Esquema da abordagem experimental adotada pela técnica de SAGE (figura obtida do protocolo original, disponível em www.sagenet.org).

10. 1 2 3 28 S 18 S 4 S SAGE • Extração RNA :

11. SAGE Síntese da dupla fita. A) Representação esquemática da síntese da dupla fita de cDNA; B) RT-PCR: linhas 1 e 2 são amplificações com, GAPD da amostra linhagem granulocítica (1) e amostra da linhagem ertitrocitária (2); linhas 3 e 4 são amplificações com EEF1A1 da amostra linhagem granulocítica (3) e amostra da linhagem eritrocitária.

12. SAGE Digestão com a enzima Nla III. Representação esquemática da digestão em seguida da captura da região de interesse. B) PCR usando “primers” específicos para GAPDH (linha 2) e EEF1A1 (linha 4). Após a digestão, um sítio de ligação do primer GAPDH é perdido (linha 3), enquanto os sítios para EEF1A1 continuam intactos (linha 5).

13. SAGE Ligação do adaptador nos “pools” A (linhagem granulocítica) e B (linhagem eritróide). A) representação esquemática da ligação. B) PCR usando “primers” específicos de cada adaptador e para o gene EEF1A1. As linhas 1 e 3 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de “primers” correto, DTP-1 com o “pool” A e DTP-2 com o “pool” B. As linhas 2 e 4 correspondem ao produto de PCR com o conjunto de “primers” trocados

14. SAGE Formação dos “tags”. A) representação esquemática da clivagem com BsmFI. B) Produto da amplificação para verificar a eficiência da digestão. Linhas 1 e 3, e linhas 2 e 4 representam amplificação do “pool” A e B antes e depois da digestão, respectivamente.

15. SAGE Ligação e expansão dos “ditags”. A) Representação esquemática. B) Amplificação dos “ditags” nas diluições 1:20 (1), 1:40 (2), 1:80 (3); controle positivo (4), controle negativo sem ligase (5) e branco (6). C) Produtos precipitados da amplificação em grande escala com a diluição 1:120.

16. SAGE Digestão e purificação dos “ditags”. A) Representação esquemática da digestão com NlaIII para liberação dos “ditags”. B) Gel de poliacrilamida com os fragmentos resultantes da digestão enzimática. O fragmento de 26 pb foi purificado para a formação dos concatâmeros.

17. SAGE Ligação dos “ditags” e formação dos concatâmeros. A) Representação esquemática. B) Gel de poliacrilamida com o perfil de fragmentos de concatâmeros; o marcador é utilizado para orientar no isolamento dos fragmentos a serem clonados.

18. SAGE

19. Est. Vermelho Normal 2.191 10.633 15.809 4.234 2.224 2.040 9.230 Est. Branco SAGE total de tags sequenciadas: 60.000

20. Genes + expressos estímulo branco