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DEFENSAS ANTIOXIDANTES EN PLATHELMINTOS - PowerPoint PPT Presentation


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DEFENSAS ANTIOXIDANTES EN PLATHELMINTOS. Curso de Biología Parasitaria 2010. - Organismos multicelulares. - Ciclos de vida complejos :. - varios estadios de desarrollo - migración tisular. - Hábitat variados : . - intestino - vasos sanguíneos - órganos linfáticos - varios.

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- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

DEFENSAS ANTIOXIDANTES

EN PLATHELMINTOS

Curso de Biología Parasitaria

2010

slide2

- Organismos multicelulares

- Ciclos de vida complejos:

- varios estadios de desarrollo

- migración tisular

- Hábitat variados:

- intestino

- vasos sanguíneos

- órganos linfáticos

- varios

PLATHELMINTOS

slide3

Parásito

Estimación

1/3 población

mundial

Helmintos intestinales

200-300 millones

Esquistosomas

Parásitos filariales

>150 millones

PREVALENCIA GLOBAL DE INFECCIÓN POR

HELMINTOS HUMANOS

slide6

BLANCOS DE LAS EROs

LIPIDOS PROTEÍNAS ADN CARBOHIDRATOS

Oxidación de grupos tioles

Formación de grupos carbonilos

Lipoperoxidación

Daños en el DNA

Bases de schiff

Ribosilación de

poly ADP

Alteración de la

expresión genética

Daños a los sistemas transportadores ionicos

Daños

en las

membranas

Inestabilidad para mantener gradientes iónicos normales

Ruptura de ATP

y NAD(P)(H)

AGEs

(Advanced glycation end products)

Activación/Desactivación de varios sistemas enzimáticos

DAÑO CELULAR

slide7

ALTAS

CONCENTRACIONES

DE EROs

ESTRÉS

OXIDATIVO

DAÑO

OXIDATIVO

Si los EROs no son neutralizados o sus efectos reparados puede producirse la muerte del organismo

Por lo tanto todos los organismos aeróbicos han desarrollado sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para prevenir o reparar el daño oxidativo.

slide8

ox

red

red

red

NADPH

Glutatión

reductasa

Glutatión

Glutarredoxina

Blancos

NADP+

ox

ox

ox

red

Glutatión peroxidasa

ox

red

MECANISMOS ENZIMÁTICOS

● SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD)

●CATALASA

● GLUTATIÓN-S-TRANSFERASA (GST)

●SISTEMA GLUTATIÓN

slide9

red

red

red

red

NADPH

Tiorredoxina reductasa

Tiorredoxina peroxidasa

Tiorredoxina

Blancos

NADP+

ox

ox

ox

ox

MECANISMOS ENZIMÁTICOS

●SISTEMA TIORREDOXINA

slide11

ESTUDIOS DE RESISTENCIA AL ATAQUE OXIDATIVO

Nare et al., 1990.Experimental parasitology, 70:389-397.

● El estadio adulto de S. mansoni es más resistentes al ataque oxidativo generado in vitro.

slide12

Nare et al., 1990.Experimental parasitology, 70:389-397.

Mei and LoVerde, 1997. Experimental Parasitology, 86:69-78.

NIVELES DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES

● La mayor resistencia del estadio adulto al ataque oxidativo se correlaciona con niveles altos de enzimas antioxidantes.

slide13

LOCALIZACIÓN DE LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES

●Se inmunolocalizaron en el tegumento y en el aparatato digestivo

Mei and LoVerde, 1997. Experimental Parasitology, 86:69-78.

slide15

ESTUDIOS REALIZADOS CON F. hepatica

Piedrafita, et al. Parasite Immunology (2000), 22: 287-295.

 Experimentos realizados con juveniles de F. hepatica incubados en conjunto con schistosómulas vuelven resistentes a estas últimas frente al ataque oxidativo generado

slide16

LOS PARÁSITOS ESTÁN MUY BIEN ADAPTADOS

AL ESTRÉS OXIDATIVO

- alta expresión de enzimas antioxidantes

- alta concentración de estas enzimas en la interfase huésped-parásito:

- Productos de excreción/secreciones

- Superficie de los parásitos

slide17

ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN LAS DIFERENTES CLASES DE PLATHELMINTOS

  • - (CuZn)SOD: formas citosólica y secretadas
  • MnSOD
  • GPx
  • Grx
  • - GST
  • - Sistema Tiorredoxina
slide18

SCHISTOSOMA MANSONI

50uM H2O2

A. Anti-GST26 tratados con GFP dsRNA.

B. Anti-GST26 tratados GST26 dsRNA.

C. Anti-Prx1/2 tratados con GFP dsRNA.

D. Anti-Prx1/2 tratados con Prx1/2 dsRNA

Mourao M de et at. PLOS Neglected Tropical Diseases (2009), 3:1-9.

slide19

CONCLUSIONES

● Los niveles de enzimas antioxidantes en plathelmintos se correlacionan positivamente con la capacidad de supervivencia frente a los EROs generados por el huésped.

● Los niveles de enzimas antioxidantes son regulados a lo largo del ciclo de desarrollo del parásito y se encuentran influenciados por:

- Hábitat parasitado

- Metabolismo energético en los diferentes estadios

- Presión inmunológica

●Las distintas clases de helmintos presentan diferentes tipos y niveles de expresión enzimática.

● Las enzimas antioxidantes prometen ser buenos blancos para vacunas mediante:

- Inmunización con enzimas purificadas

- Diseño de drogas que inhiban selectivamente estas enzimas

slide21

SOD

TPX GPX

slide22

SISTEMA TIORREDOXINA

red

red

red

red

NADPH

Tiorredoxina reductasa

Tiorredoxina peroxidasa

Tiorredoxina

Blancos

NADP+

ox

ox

ox

ox

SISTEMA GLUTATIÓN

ox

red

red

red

NADPH

Glutatión

reductasa

Glutatión

Glutarredoxina

Blancos

NADP+

ox

ox

ox

red

Glutatión peroxidasa

ox

red

slide23

región interfase

región interfase

TR

GCUG

GCUG

CVNVGC

CVNVGC

NADPH

NADPH

FAD

FAD

región interfase

CVNVGC

NADPH

FAD

GR

Grx

GSH

CPYC

TGR

dominio

Grx

CPYC

GSH

dominio

TR

ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR

slide24

66 kDa

66 kDa

45 kDa

TR

36 kDa

29 kDa

24 kDa

10 mM GSH

PM 9 10

PM 1 2 3 4 5 6 7 8

66 kDa

45 kDa

36 kDa

PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA

slide25

Fasciola 1

----------------------------------------MAPIPDDTS-----------

-----------------------------------------MPPADGTS-----------

SmanTGR 1

EgraTGR 1

-------------MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV---------

V

LLFSKS--------R

CPYC

RAVKQIFNDDKVNHAVIELD

---------SWVKKTINSSA

Fasciola 9

Grx

SmanTGR 8

---------QWLRKTVDSAA

V

ILFSKT--------T

CPYC

KKVKDVLAEAKIKHATIELD

V

EgraTGR 38

---------EKLRNKINNAA

LVFAKS--------F

CPYC

KKVMERFNNLKIPFGYLDLD

Fasciola 53

KRPDGAKI

Q

QVLSQISGISTV

P

QVFVRGEFV

G

DSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTY

DYDL

SmanTGR 52

QLSNGSAI

Q

KCLASFSKIETV

P

QMFVRGKFI

G

DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKY

DYDL

EgraTGR 82

LKKNGSDY

Q

KMLQEITGRTTV

P

QVFFRGEFI

G

GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKY

DYD

M

Fasciola 112

VV

IGGGSGGL

A

AS

KEAA

RF

G

A

K

TAVF

DFV

V

P

T

P

QD

T

TR

GLGGT

CVNVGC

IPKKLMHQA

A

L

centro redox

SmanTGR 111

IV

IGGGSGGL

AAG

KEAA

KY

G

A

K

TAV

LD

Y

V

E

P

T

P

I

GT

T

WGLGGT

CVNVGC

IPKKLMHQA

G

L

sitio de unión al FAD

EgraTGR 140

VI

IGGGSGGL

ALA

KE

S

A

KS

G

A

K

VAL

LDFV

V

P

T

P

M

GT

T

WGLGGT

CVNVGC

IPKKLMHQA

A

L

GASYVALECAGFLTRFG

Fasciola 292

V

V

F

D

MA

P

T

T

TVMV

R

SI

F

L

R

GFDQ

Q

DMIGEYMKEH

G

T

KF

VRSCV

SmanTGR 291

VI

GASYVALECAGFLASLG

G

DVTVMV

R

SI

L

L

R

GFDQ

Q

MA

EKVGDYMENH

G

V

P

D

KF

AKLCV

EgraTGR 318

C

V

GASYVSLECAGFLSSIG

C

DVTVMV

R

SI

F

L

R

GFDQ

Q

MA

GLISDYIAKY

G

V

KF

VRPCV

P

T

sitio de unión al NADPH

Fasciola

584

D

SG

-ASAKVTA

C

U

G

TK

SmanTGR

584

TK

K

SG

-VSPIVS

GC

U

G

EgraTGR

610

TK

S

SG

-ASATVT

GC

U

G

selenocisteína

ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA

slide26

red

Blancos

NADPH

NADP+

ox

red

red

red

Tiorredoxina peroxidasa

Tiorredoxina glutatión reductasa

Tiorredoxina

Blancos

ox

ox

ox

dominio

TR

dominio

Grx

TIORREDOXINA GLUTATIÓN REDUCTASA

slide27

red

red

red

NADPH

TGR

Insulina

Tiorredoxina

+

+

NADP+

NADPH

ox

NADP+

DTNB

2 TNB

(actividad TR)

ox

ox

(reacción espontánea)

ESSE + GSH

GSSE + ESH

GSSG + NADPH + H+

(actividad GR)

2GSH + NADP+

(actividad Grx)

GSSG + ESH

GSSE + GSH

ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR

slide28

red

Blancos

NADPH

NADP+

ox

red

red

red

Tiorredoxina peroxidasa

Tiorredoxina glutatión reductasa

Tiorredoxina

Blancos

ox

ox

ox

dominio

TR

dominio

Grx

ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR

- La enzima purificada posee actividad TR, GR y Grx

- Todas estas actividades son inhibidas con sales de oro

La fusión de dominios codificada en el gen de la TGR hace posible que la enzima sea capaz de transferir electrones a los blancos de ambos sistemas

slide29

Mic Mit Cit Nuc Tot

66 kDa

¿Hay TGR en los compartimientos

mitocondrial y citosólico?

slide30

Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR

Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales?

slide31

EN OTROS PLATHELMINTOS

Taenia crassiceps:

Seguimiento de una actividad GR y TR resultaron en la purificación de una TGR

(Rendon et al. 2004)

Schistosoma mansoni:

Auranofin inhibe las actividades GR y TR en extractos de parásitos

(Alger and Williams, 2003)

slide33

- Resultados similares se encontraron en E. granulosus y E. multilocularis

. Ausencia de GR y TR

. Presencia de Trx y TPx mitocondrial y citosolica

En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR

slide34

semana 4

semana 0

semana 6

semana 18

Desafío

Sacrificio

- 50 metacercarias

1º inmunización

2º inmunización

- 100 μg FhTGR

- PBS

- 100 μg FhTGR

- PBS

ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica

slide35

Schistosoma mansoni

Auranofin: En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente.

Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

slide36

Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito.

Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

slide37

Tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásitos encontrados.

Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

slide38

Echinococcus granulosus

A- Control B- 12h C- 30h

Bonilla et al. The journal of biological chemistry, (2008) 283:17898-17907.