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DEFENSAS ANTIOXIDANTES EN PLATHELMINTOS

DEFENSAS ANTIOXIDANTES EN PLATHELMINTOS. Curso de Biología Parasitaria 2010. - Organismos multicelulares. - Ciclos de vida complejos :. - varios estadios de desarrollo - migración tisular. - Hábitat variados : . - intestino - vasos sanguíneos - órganos linfáticos - varios.

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DEFENSAS ANTIOXIDANTES EN PLATHELMINTOS

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Presentation Transcript

  1. DEFENSAS ANTIOXIDANTES EN PLATHELMINTOS Curso de Biología Parasitaria 2010

  2. - Organismos multicelulares - Ciclos de vida complejos: - varios estadios de desarrollo - migración tisular - Hábitat variados: - intestino - vasos sanguíneos - órganos linfáticos - varios PLATHELMINTOS

  3. Parásito Estimación 1/3 población mundial Helmintos intestinales 200-300 millones Esquistosomas Parásitos filariales >150 millones PREVALENCIA GLOBAL DE INFECCIÓN POR HELMINTOS HUMANOS

  4. DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN

  5. ESPECIES REACTIVAS DEL OXÍGENO Y DEL NITRÓGENO

  6. BLANCOS DE LAS EROs LIPIDOS PROTEÍNAS ADN CARBOHIDRATOS Oxidación de grupos tioles Formación de grupos carbonilos Lipoperoxidación Daños en el DNA Bases de schiff Ribosilación de poly ADP Alteración de la expresión genética Daños a los sistemas transportadores ionicos Daños en las membranas Inestabilidad para mantener gradientes iónicos normales Ruptura de ATP y NAD(P)(H) AGEs (Advanced glycation end products) Activación/Desactivación de varios sistemas enzimáticos DAÑO CELULAR

  7. ALTAS CONCENTRACIONES DE EROs ESTRÉS OXIDATIVO DAÑO OXIDATIVO Si los EROs no son neutralizados o sus efectos reparados puede producirse la muerte del organismo Por lo tanto todos los organismos aeróbicos han desarrollado sistemas antioxidantes enzimáticos y no enzimáticos para prevenir o reparar el daño oxidativo.

  8. ox red red red NADPH Glutatión reductasa Glutatión Glutarredoxina Blancos NADP+ ox ox ox red Glutatión peroxidasa ox red MECANISMOS ENZIMÁTICOS ● SUPERÓXIDO DISMUTASA (SOD) ●CATALASA ● GLUTATIÓN-S-TRANSFERASA (GST) ●SISTEMA GLUTATIÓN

  9. red red red red NADPH Tiorredoxina reductasa Tiorredoxina peroxidasa Tiorredoxina Blancos NADP+ ox ox ox ox MECANISMOS ENZIMÁTICOS ●SISTEMA TIORREDOXINA

  10. DEFENSA DEL HUÉSPED CONTRA LA INFECCIÓN

  11. ESTUDIOS DE RESISTENCIA AL ATAQUE OXIDATIVO Nare et al., 1990.Experimental parasitology, 70:389-397. ● El estadio adulto de S. mansoni es más resistentes al ataque oxidativo generado in vitro.

  12. Nare et al., 1990.Experimental parasitology, 70:389-397. Mei and LoVerde, 1997. Experimental Parasitology, 86:69-78. NIVELES DE ENZIMAS ANTIOXIDANTES ● La mayor resistencia del estadio adulto al ataque oxidativo se correlaciona con niveles altos de enzimas antioxidantes.

  13. LOCALIZACIÓN DE LAS ENZIMAS ANTIOXIDANTES ●Se inmunolocalizaron en el tegumento y en el aparatato digestivo Mei and LoVerde, 1997. Experimental Parasitology, 86:69-78.

  14. ESTUDIOS REALIZADOS CON F. hepatica Piedrafita, et al. Parasite Immunology (2000), 22: 287-295.  Experimentos realizados con juveniles de F. hepatica incubados en conjunto con schistosómulas vuelven resistentes a estas últimas frente al ataque oxidativo generado

  15. LOS PARÁSITOS ESTÁN MUY BIEN ADAPTADOS AL ESTRÉS OXIDATIVO - alta expresión de enzimas antioxidantes - alta concentración de estas enzimas en la interfase huésped-parásito: - Productos de excreción/secreciones - Superficie de los parásitos

  16. ENZIMAS ANTIOXIDANTES EN LAS DIFERENTES CLASES DE PLATHELMINTOS • - (CuZn)SOD: formas citosólica y secretadas • MnSOD • GPx • Grx • - GST • - Sistema Tiorredoxina

  17. SCHISTOSOMA MANSONI 50uM H2O2 A. Anti-GST26 tratados con GFP dsRNA. B. Anti-GST26 tratados GST26 dsRNA. C. Anti-Prx1/2 tratados con GFP dsRNA. D. Anti-Prx1/2 tratados con Prx1/2 dsRNA Mourao M de et at. PLOS Neglected Tropical Diseases (2009), 3:1-9.

  18. CONCLUSIONES ● Los niveles de enzimas antioxidantes en plathelmintos se correlacionan positivamente con la capacidad de supervivencia frente a los EROs generados por el huésped. ● Los niveles de enzimas antioxidantes son regulados a lo largo del ciclo de desarrollo del parásito y se encuentran influenciados por: - Hábitat parasitado - Metabolismo energético en los diferentes estadios - Presión inmunológica ●Las distintas clases de helmintos presentan diferentes tipos y niveles de expresión enzimática. ● Las enzimas antioxidantes prometen ser buenos blancos para vacunas mediante: - Inmunización con enzimas purificadas - Diseño de drogas que inhiban selectivamente estas enzimas

  19. SISTEMAS LIGADOS Trx-GSH EN PLATHELMINTOS

  20. SOD TPX GPX

  21. SISTEMA TIORREDOXINA red red red red NADPH Tiorredoxina reductasa Tiorredoxina peroxidasa Tiorredoxina Blancos NADP+ ox ox ox ox SISTEMA GLUTATIÓN ox red red red NADPH Glutatión reductasa Glutatión Glutarredoxina Blancos NADP+ ox ox ox red Glutatión peroxidasa ox red

  22. región interfase región interfase TR GCUG GCUG CVNVGC CVNVGC NADPH NADPH FAD FAD región interfase CVNVGC NADPH FAD GR Grx GSH CPYC TGR dominio Grx CPYC GSH dominio TR ORGANIZACIÓN DE LA TR, GR, Grx y TGR

  23. 66 kDa 66 kDa 45 kDa TR 36 kDa 29 kDa 24 kDa 10 mM GSH PM 9 10 PM 1 2 3 4 5 6 7 8 66 kDa 45 kDa 36 kDa PURIFICACIÓN DE LA ENZIMA NATIVA

  24. Fasciola 1 ----------------------------------------MAPIPDDTS----------- -----------------------------------------MPPADGTS----------- SmanTGR 1 EgraTGR 1 -------------MFGCHCLRRACTPLSAIACFFNPRRTAMAPIGGSAEQV--------- V LLFSKS--------R CPYC RAVKQIFNDDKVNHAVIELD ---------SWVKKTINSSA Fasciola 9 Grx SmanTGR 8 ---------QWLRKTVDSAA V ILFSKT--------T CPYC KKVKDVLAEAKIKHATIELD V EgraTGR 38 ---------EKLRNKINNAA LVFAKS--------F CPYC KKVMERFNNLKIPFGYLDLD Fasciola 53 KRPDGAKI Q QVLSQISGISTV P QVFVRGEFV G DSSTISKLKKEDKLTEVIKK-NTY DYDL SmanTGR 52 QLSNGSAI Q KCLASFSKIETV P QMFVRGKFI G DSQTVLKYYSNDELAGIVNE-SKY DYDL EgraTGR 82 LKKNGSDY Q KMLQEITGRTTV P QVFFRGEFI G GCDDVMAID-DDTIVKKANE-MKY DYD M Fasciola 112 VV IGGGSGGL A AS KEAA RF G A K TAVF DFV V P T P QD T TR GLGGT CVNVGC IPKKLMHQA A L centro redox SmanTGR 111 IV IGGGSGGL AAG KEAA KY G A K TAV LD Y V E P T P I GT T WGLGGT CVNVGC IPKKLMHQA G L sitio de unión al FAD EgraTGR 140 VI IGGGSGGL ALA KE S A KS G A K VAL LDFV V P T P M GT T WGLGGT CVNVGC IPKKLMHQA A L GASYVALECAGFLTRFG Fasciola 292 V V F D MA P T T TVMV R SI F L R GFDQ Q DMIGEYMKEH G T KF VRSCV SmanTGR 291 VI GASYVALECAGFLASLG G DVTVMV R SI L L R GFDQ Q MA EKVGDYMENH G V P D KF AKLCV EgraTGR 318 C V GASYVSLECAGFLSSIG C DVTVMV R SI F L R GFDQ Q MA GLISDYIAKY G V KF VRPCV P T sitio de unión al NADPH Fasciola 584 D SG -ASAKVTA C U G TK SmanTGR 584 TK K SG -VSPIVS GC U G EgraTGR 610 TK S SG -ASATVT GC U G selenocisteína ANÁLISIS DE LA SECUENCIA AMINOACÍDICA

  25. red Blancos NADPH NADP+ ox red red red Tiorredoxina peroxidasa Tiorredoxina glutatión reductasa Tiorredoxina Blancos ox ox ox dominio TR dominio Grx TIORREDOXINA GLUTATIÓN REDUCTASA

  26. red red red NADPH TGR Insulina Tiorredoxina + + NADP+ NADPH ox NADP+ DTNB 2 TNB (actividad TR) ox ox (reacción espontánea) ESSE + GSH GSSE + ESH GSSG + NADPH + H+ (actividad GR) 2GSH + NADP+ (actividad Grx) GSSG + ESH GSSE + GSH ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR

  27. red Blancos NADPH NADP+ ox red red red Tiorredoxina peroxidasa Tiorredoxina glutatión reductasa Tiorredoxina Blancos ox ox ox dominio TR dominio Grx ENSAYOS DE ACTIVIDAD TR, Grx y GR - La enzima purificada posee actividad TR, GR y Grx - Todas estas actividades son inhibidas con sales de oro La fusión de dominios codificada en el gen de la TGR hace posible que la enzima sea capaz de transferir electrones a los blancos de ambos sistemas

  28. Mic Mit Cit Nuc Tot 66 kDa ¿Hay TGR en los compartimientos mitocondrial y citosólico?

  29. Echinococcus granulosus posee variantes mitocondriales y citosólicas de TGR Tiene E. granulosus TR, GR and Grx convencionales?

  30. EN OTROS PLATHELMINTOS Taenia crassiceps: Seguimiento de una actividad GR y TR resultaron en la purificación de una TGR (Rendon et al. 2004) Schistosoma mansoni: Auranofin inhibe las actividades GR y TR en extractos de parásitos (Alger and Williams, 2003)

  31. - Resultados similares se encontraron en E. granulosus y E. multilocularis . Ausencia de GR y TR . Presencia de Trx y TPx mitocondrial y citosolica En plathelmintos, se postula a la TGR como la responsable de llevar a cabo ambas funciones, GR y TR

  32. semana 4 semana 0 semana 6 semana 18 Desafío Sacrificio - 50 metacercarias 1º inmunización 2º inmunización - 100 μg FhTGR - PBS - 100 μg FhTGR - PBS ESTUDIO DE INMUNOPROTECCIÓN EN CONEJOS CONTRA F. hepatica

  33. Schistosoma mansoni Auranofin: En ensayos in vitro y utilizando concentraciones fisiológicas se observó que los parásitos mueren rápidamente. Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

  34. Utilizando un ARNi, se observó que la TGR es esencial para la vida del parásito. Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

  35. Tratando a ratones infectados con este compuesto se observó una reducción del 60% de los parásitos encontrados. Kuntz et al. PLOS medicine (2007), 4:1071-1086

  36. Echinococcus granulosus A- Control B- 12h C- 30h Bonilla et al. The journal of biological chemistry, (2008) 283:17898-17907.

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