Download
1 / 45
450 likes | 690 Views
Elective Course for Biotechnology. 基因工程技术 Genetic Engineering. Zhong, Weihong, PhD College of Biological & Environmental Engineering 2006-09-25. 不论地球上的哪一种生命，只要其生命的 DNA 长链优美地打开时，生命创造就开始了。. 第六节 基因表达的调控. 6.1 原核基因表达调控. 6.1.1 转录调控的原理. 6.1.1.1 基因表达由调控蛋白控制. 活化子和抑制子的协助结合或阻碍作用.
E N D
Elective Course for Biotechnology 基因工程技术Genetic Engineering Zhong, Weihong, PhD College of Biological & Environmental Engineering 2006-09-25
不论地球上的哪一种生命，只要其生命的DNA长链优美地打开时，生命创造就开始了。不论地球上的哪一种生命，只要其生命的DNA长链优美地打开时，生命创造就开始了。
第六节 基因表达的调控 6.1 原核基因表达调控 6.1.1 转录调控的原理 6.1.1.1 基因表达由调控蛋白控制
活化子和抑制子的协助结合或阻碍作用 通过募集RNA聚合酶激活转录 a. 在调控蛋白不存在时，RNA聚合酶微弱地结合于启动子上，起始基础水平的转录。b. 抑制子结合在操作子上，阻碍了聚合酶的结合，从而抑制了转录。c. 活化子募集聚合酶，刺激转录。
6.1.1.3 活化子刺激聚合酶的变构 变构激活RNA聚合酶 a. 闭合式复合体虽然结合在启动子上，但是不能异构化，因此没有转录。b. 活化子刺激开放式复合体的形成，从而激活转录。
6.1.1.4 远程激活和DNA环化 DNA结合蛋白的相互作用 a. 蛋白结合位点相邻。b. 分离的位点。
6.1.2 转录起始的调控 6.1.2.1 乳糖操纵子 lac操纵子模型 三个基因(lacZ、lacY和lacA)以一条mRNA从启动子(如箭头所示)转录。CAP和操作子各约为20bp。操作子(lacO)位于启动子RNA聚合酶结合区内，CAP位点位于启动子上游。
6.1.2.2 活化子和抑制子对lac基因的双调控机理 乳糖和葡萄糖的有无控制着lac基因表达的水平。高水平的表达需要乳糖的存在(抑制了Lac抑制子活性)同时要缺少葡萄糖(才有活化子CAP)。当Lac抑制子结合到操作子上，不管CAP是否存在，聚合酶不能结合，因此没有转录 lac基因的表达（图）
lac操作子对称的半位点 lac操纵子的控制区域 操纵子控制区域的核苷酸序列和组织结构。操纵子上面的横杆表示RNA聚合酶和调控蛋白CAP覆盖的DNA区域，下面的横杆表示抑制子的覆盖区域。注意RNA聚合酶覆盖的区域大于启动子区，而抑制子覆盖的区域大于操作子序列，尤其是往上游方向的延伸，这两个区域发生一定长度的重叠。
6.1.2.3 CAP具有独立的激活域和DNA结合域 lac启动子被CAP激活 RNA聚合酶在CAP的协助下，结合到启动子上。CAP由α亚基的CTD识别。当与CAP相互作用时，α亚基CTD也在CAP位点附近与DNA分子发生接触。
6.1.2.4 调控蛋白以相同的结构模体与DNA结合 蛋白以二聚体结合，两个亚基用圆柱体表示，其中识别螺旋标上R字母。 具有螺旋-转角-螺旋结构域的蛋白质结合DNA的模型
6.1.2.5 调控蛋白的活性由信号变构控制 6.1.2.5.1 Lac抑制子 Lac抑制子的变构 a. 诱导物-Lac抑制子的二聚体。与诱导物的结合导致结构的改变，从而降低了抑制子对操作子的亲和性。b. 没有诱导物存在下，两个二聚体之间形成铰链，因此N端结构域能与操作子序列结合。
6.1.3 转录起始后的基因调控 6.1.3.1 色氨酸操纵子：弱化子调控 trp操纵子 先导区(leader)与结构基因的关系。基因产物是5个酶，分别是氨基苯甲酸合成酶、氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶、phosphoribosyl anthranilate isomerase-indole glycerol phosphate synthetase、β-色氨酸合成酶和α-色氨酸合成酶。
先导序列具有的三个特征，使RNA聚合酶在色氨酸浓度低时通过弱化子(即抗弱化)。先导序列具有的三个特征，使RNA聚合酶在色氨酸浓度低时通过弱化子(即抗弱化)。 a) 除了3区和4区的发夹外，在1区和2区之间还可以形成第二个发夹。 b) 2区和3区也可以形成发夹。
c)先导序列包括一个可读框，它编码一个短的14个氨基酸的先导肽，先导肽的序列见下图 。 trp操纵子先导RNA
6.1.3.2 基因表达翻译水平的调节 在trp操纵子上，弱化子的转录终止作用取决于色氨酸的浓度。a. 高色氨酸条件下，序列3和4配对，形成转录终止发夹。b. 低色氨酸条件下，核糖体停在色氨酸密码子附近，序列1被核糖体覆盖，序列2和3配对，因此阻止了3、4之间形成转录终止发夹。c 没有蛋白合成时，如果没有核糖体起始先导肽的翻译，序列1、2形成发夹，阻止了2、3发夹的形成，允许序列3、4形成转录终止发夹，酶不表达。 trp弱化子的转录终止作用
E. coli的核糖体蛋白操纵子 每次翻译时作为其它蛋白的翻译抑制子的蛋白是深灰色部分，如L11、L10、S7、L4、S8和S4。
6.1.4 DNA重排对基因表达的调节 沙门氏菌属的相变机理
6.2 真核基因表达的凋控 6.2.1 真核基因表达调控的特点 在真核基因表达的调控中至少有4个带普遍性的与原核不同的机理 ①原核的染色质是裸露的DNA，而真核的染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成为核小体。 ②与典型的原核基因相比，大多数真核基因通常都有更多的调节结合位点，并被更多数目的调控蛋白调控，这一点可以从基因调节蛋白结合位点的数目和排列上看出来。
③原核基因的转录和翻译通常是在同一地点、同时进行的，即在转录尚未完成之前翻译工作已经开始了。 ④真核生物大都为多细胞生物，在个体发育过程中发生细胞分化后，不同细胞的功能不同，基因表达的情况也不一样，某些基因仅特异地在某种细胞中表达(称为细胞特异性或组织特异性表达)，因而具有调控这种特异性表达的机制。
对真核表达调控，可以在以下几个环节进行： ①DNA和染色体水平上的调控 ②转录水平上调控 ③转录后RNA加工过程和运送中的调控 ④翻译水平上的调控 ⑤翻译后的控制 ⑥mRNA降解的控制 真核基因表达调控的几个环节
6.2.2 从酵母到哺乳动物转录调节的保守机制 6.2.2.1 活化子的DNA结合与激活功能的分离 Gal4以二聚体的形式与DNA上一段17bp的位点结合。该蛋白的DNA结合区与激活区是分离的。 Gal4与DNA上位点的结合
酵母GAL1基因的调节序列 GAL1 的上游序列(UASG)有4个位点，每个位点与一个Gal4二聚体结合。
域交换实验 • 没有激活域，Gal4的DNA结合域仍能结合DNA，但是不 能激活转录。 • b. Gal4激活转录不依赖于其特异的DNA结合域。
6.2.2.2 真核细胞调节蛋白使用一系列DNA结构域 6.2.2.2.1 同型结构域蛋白质 由三段α-螺旋组成，其中两段(螺旋2和3)螺旋形成类似于螺旋-转角-螺旋的模式 同型结构域识别DNA
6.2.2.2.2 含锌DNA结构域 a.典型的锌指蛋白，由2个半胱氨酸和2个组氨酸残基组成，锌原子处于中部。 b.类固醇受体，由4个半胱氨酸残基组成。 锌指结构域
6.2.2.2.3 亮氨酸拉链 a.疏水侧面相互作用。 b. 2个巨大的α-螺旋将DNA夹住。 亮氨酸拉链
6.2.2.2.4 螺旋-环-螺旋 螺旋-环-螺旋模体 6.2.2.3 激活域结构的不确定性
6.2.3 通过活化子募集基因结合的蛋白复合体 6.2.3.1 活化子募集基因转录机器 图中仅仅显示了一个活化子募集两个目标，中介蛋白和通用转录因子TFIID。其它通用转录因子或者被活化子募集，或者被中介蛋白/通用转录因子TFIID募集。 在真核细胞中活化子通过募集转录机器激活转录开始
6.2.3.2 活化子也募集核小体修饰物，以帮助转录机器结合到启动子上 机器与启动子的结合 的局部结构，介导转录 活化子直接改变染色质 a. 活化子通过募集组蛋白乙酰化酶对组氨酸残基(标有小旗)进行乙酰化，导致核小体结构的松弛；b. 活化子募集染色质重构复合体，改变启动子附近的核小体结构。
6.2.3.3 远距离作用：DNA环和绝缘子 a. 与增强子结合的活化子对启动子的激活。b. 绝缘子位于增强子和启动子之间，当适当的蛋白与之结合后，尽管活化子和增强子结合，活化子对启动子的作用仍被阻断。c. 活化子能够激活附近的另外一个启动子。d. 启动子能被下游的另一个增强子激活。也就是，说无论是活化子还是启动子，都不会因绝缘子而失活。 绝缘子阻止增强子的活性
6.2.4 信号整合与组合的控制 6.2.4.1 活化子之间协同作用促进信号整合 协同主要有以下3个方式： a) 多个活化子募集转录机器的同一组分。 b) 多个活化子募集转录机器的不同组分。 c) 多个活化子相互帮助与所调控基因上游的位点相结合。
6.2.4.2 信号整合实例：HO基因 在染色质中，SWI5能独立地与它的位点结合，但SBF不能。SWI5募集重塑分子和组蛋白乙酰化酶后，改变了核小体的特性，从而暴露出SBF的位点，使得SBF在启动子附近结合，从而激活基因。 对HO基因的控制
6.2.4.3 组合控制体现真核细胞的复杂性和多样性 组合控制 两个基因都受多个信号控制。蛋白3在这2个基因中与不同的一组调节蛋白进行组合。
6.2.5 信号转导对转录调节子的调控 6.2.5.1 信号通过信号转导途径传递至转录调节子 哺乳动物细胞MAP激酶的Ras信号转导途径
6.2.5.2 信号调控转录调节子的多种方式 转录调节子通常不在DNA结合水平上被调控，而是通过下述两种基本方式之一被调控： 缺乏半乳糖时，Gal4能结合在GAL1基因上，但是掩蔽蛋白Gal80与Gal4的结合使其不能激活基因的转录。半乳糖的存在触发Gal80从Gal4上解离，因此转录被激活。 a) 活化区的暴露 酵母活化子Gal4被掩蔽蛋白Gal80调节 b) 信号控制转录调节子进、出细胞核 6.2.5.3 信号决定功能
6.2.6 转录的负调控 6.2.6.1 转录抑制子的调控方式 酵母GAL1基因的抑制 当葡萄糖存在时，Mig1与位于UGSG和GAL1启动子之间的一个位点结合，通过募集Tup1抑制复合体，Mig1抑制GAL1基因的位点。
6.2.6.2 基因沉默 6.2.6.2.1 组蛋白的脱乙酰化和甲基化介导酵母基因沉默 a. 通过与活化子重叠位点的结合，抑制子抑制了活化子对基因的结合，从而阻断基因的活化。b. 抑制子结合在活化子邻近位点，位阻后者的活化区。c. 抑制子与基因上游的位点结合，通过与转录机器的相互作用抑制转录起始。d. 通过募集组蛋白修饰酶(组蛋白脱乙酰酶)改变核小体，从而抑制转录。 真核生物抑制子的作用方式
酵母端粒中的沉默效应 Rap1募集Sir复合体。Sir2是复合体中的一种组分，能使邻近的核小体脱乙酰化。随后，未被脱乙酰化的尾部与Sir3和Sir4结合，募集更多的Sir复合体，从而使得复合体中的Sir2能作用于更远处的核小体，这就解释了由于脱乙酰化引起的沉默效应的扩散。
6.2.6.2.2 哺乳动物中DNA甲基化与沉默状态的基因有关 6.2.6.2.3基因表达的某些状态随着细胞分裂遗传 DNA甲基化与组蛋白修饰关闭基因的表达
DNA甲基化模式可以通过细胞分裂得以维持 DNA被复制后，一种维持性的甲基化酶识别半甲基化的DNA，随后在其中未被甲基化的胞嘧啶上加上甲基基团。完全未被甲基化的序列不能被甲基化识别，仍然保持非甲基化状态。因此两个子代DNA双链的甲基化模式与母链完全相同。
6.2.7 转录起始后的真核基因调节 6.2.7.1 某些活化子控制转录延伸而不是转录起始 6.2.7.2 mRNA可变剪接的调节 6.2.7.3 翻译水平上的调节
确定果蝇性别的可变剪接的级联反应 Sxl蛋白只在雌性果蝇中表达(图的右边)。Sxl的存在是通过它对自己信使的剪接的调节来维持的。如果没有这种调节，就没有Sxl的合成，最终发育为雄性个体。Sxl还调节tra的剪接，在雌性个体中生成功能性的Tra蛋白。在Tra的作用下，dsx mRNA经过剪接后翻译的蛋白Dsx在其C端包含一段30个氨基酸的肽，能活化雌性发育的基因，抑制雄性发育的基因。
6.2.8 基因调节中的RNAi 酵母活化子Gcn4的可读框上游包含4个其它可读框(uORF)，最上游的ORF1先翻译。在氨基酸饥饿时，重新启动翻译机器需要更长的时间，因此它更容易到达GCN4的ORF完成翻译过程。而当氨基酸充足时，重新启动翻译机器的工作在中间的ORF完成，没有到达GCN4就与RNA脱离，Gcn4得不到翻译。 Gcn4的翻译水平的调节
6.2.8.1 siRNA 当dsRNA分子与细胞中引入或产生的基因同源时，siRNA切断基因的表达。首先在Dicer的作用下，dsRNA产生siRNA，siRNA接着控制RISC复合体，采用正文中描述的三种方法抑制基因的表达。 RNAi沉默
