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Elective Course for Biotechnology. 基因工程技术 Genetic Engineering. Zhong, Weihong, PhD College of Biological & Environmental Engineering 2006-09-25. 不论地球上的哪一种生命,只要其生命的 DNA 长链优美地打开时,生命创造就开始了。. 第六节 基因表达的调控. 6.1 原核基因表达调控. 6.1.1 转录调控的原理. 6.1.1.1 基因表达由调控蛋白控制. 活化子和抑制子的协助结合或阻碍作用.

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Presentation Transcript
genetic engineering

Elective Course for Biotechnology

基因工程技术Genetic Engineering

Zhong, Weihong, PhD

College of Biological & Environmental Engineering

2006-09-25

slide2

不论地球上的哪一种生命,只要其生命的DNA长链优美地打开时,生命创造就开始了。不论地球上的哪一种生命,只要其生命的DNA长链优美地打开时,生命创造就开始了。

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第六节 基因表达的调控

6.1 原核基因表达调控

6.1.1 转录调控的原理

6.1.1.1 基因表达由调控蛋白控制

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活化子和抑制子的协助结合或阻碍作用

通过募集RNA聚合酶激活转录

a. 在调控蛋白不存在时,RNA聚合酶微弱地结合于启动子上,起始基础水平的转录。b. 抑制子结合在操作子上,阻碍了聚合酶的结合,从而抑制了转录。c. 活化子募集聚合酶,刺激转录。

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6.1.1.3 活化子刺激聚合酶的变构

变构激活RNA聚合酶

a. 闭合式复合体虽然结合在启动子上,但是不能异构化,因此没有转录。b. 活化子刺激开放式复合体的形成,从而激活转录。

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6.1.1.4 远程激活和DNA环化

DNA结合蛋白的相互作用

a. 蛋白结合位点相邻。b. 分离的位点。

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6.1.2 转录起始的调控

6.1.2.1 乳糖操纵子

lac操纵子模型

三个基因(lacZ、lacY和lacA)以一条mRNA从启动子(如箭头所示)转录。CAP和操作子各约为20bp。操作子(lacO)位于启动子RNA聚合酶结合区内,CAP位点位于启动子上游。

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6.1.2.2 活化子和抑制子对lac基因的双调控机理

乳糖和葡萄糖的有无控制着lac基因表达的水平。高水平的表达需要乳糖的存在(抑制了Lac抑制子活性)同时要缺少葡萄糖(才有活化子CAP)。当Lac抑制子结合到操作子上,不管CAP是否存在,聚合酶不能结合,因此没有转录

lac基因的表达(图)

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lac操作子对称的半位点

lac操纵子的控制区域

操纵子控制区域的核苷酸序列和组织结构。操纵子上面的横杆表示RNA聚合酶和调控蛋白CAP覆盖的DNA区域,下面的横杆表示抑制子的覆盖区域。注意RNA聚合酶覆盖的区域大于启动子区,而抑制子覆盖的区域大于操作子序列,尤其是往上游方向的延伸,这两个区域发生一定长度的重叠。

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6.1.2.3 CAP具有独立的激活域和DNA结合域

lac启动子被CAP激活

RNA聚合酶在CAP的协助下,结合到启动子上。CAP由α亚基的CTD识别。当与CAP相互作用时,α亚基CTD也在CAP位点附近与DNA分子发生接触。

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6.1.2.4 调控蛋白以相同的结构模体与DNA结合

蛋白以二聚体结合,两个亚基用圆柱体表示,其中识别螺旋标上R字母。

具有螺旋-转角-螺旋结构域的蛋白质结合DNA的模型

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6.1.2.5 调控蛋白的活性由信号变构控制

6.1.2.5.1 Lac抑制子

Lac抑制子的变构

a. 诱导物-Lac抑制子的二聚体。与诱导物的结合导致结构的改变,从而降低了抑制子对操作子的亲和性。b. 没有诱导物存在下,两个二聚体之间形成铰链,因此N端结构域能与操作子序列结合。

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6.1.3 转录起始后的基因调控

6.1.3.1 色氨酸操纵子:弱化子调控

trp操纵子

先导区(leader)与结构基因的关系。基因产物是5个酶,分别是氨基苯甲酸合成酶、氨基苯甲酸磷酸核糖基转移酶、phosphoribosyl anthranilate isomerase-indole glycerol phosphate synthetase、β-色氨酸合成酶和α-色氨酸合成酶。

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先导序列具有的三个特征,使RNA聚合酶在色氨酸浓度低时通过弱化子(即抗弱化)。先导序列具有的三个特征,使RNA聚合酶在色氨酸浓度低时通过弱化子(即抗弱化)。

a) 除了3区和4区的发夹外,在1区和2区之间还可以形成第二个发夹。

b) 2区和3区也可以形成发夹。

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6.1.3.2 基因表达翻译水平的调节

在trp操纵子上,弱化子的转录终止作用取决于色氨酸的浓度。a. 高色氨酸条件下,序列3和4配对,形成转录终止发夹。b. 低色氨酸条件下,核糖体停在色氨酸密码子附近,序列1被核糖体覆盖,序列2和3配对,因此阻止了3、4之间形成转录终止发夹。c 没有蛋白合成时,如果没有核糖体起始先导肽的翻译,序列1、2形成发夹,阻止了2、3发夹的形成,允许序列3、4形成转录终止发夹,酶不表达。

trp弱化子的转录终止作用

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E. coli的核糖体蛋白操纵子

每次翻译时作为其它蛋白的翻译抑制子的蛋白是深灰色部分,如L11、L10、S7、L4、S8和S4。

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6.1.4 DNA重排对基因表达的调节

沙门氏菌属的相变机理

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6.2 真核基因表达的凋控

6.2.1 真核基因表达调控的特点

在真核基因表达的调控中至少有4个带普遍性的与原核不同的机理

①原核的染色质是裸露的DNA,而真核的染色质则是由DNA与组蛋白紧密结合形成为核小体。

②与典型的原核基因相比,大多数真核基因通常都有更多的调节结合位点,并被更多数目的调控蛋白调控,这一点可以从基因调节蛋白结合位点的数目和排列上看出来。

slide20

③原核基因的转录和翻译通常是在同一地点、同时进行的,即在转录尚未完成之前翻译工作已经开始了。

④真核生物大都为多细胞生物,在个体发育过程中发生细胞分化后,不同细胞的功能不同,基因表达的情况也不一样,某些基因仅特异地在某种细胞中表达(称为细胞特异性或组织特异性表达),因而具有调控这种特异性表达的机制。

slide21

对真核表达调控,可以在以下几个环节进行:

①DNA和染色体水平上的调控

②转录水平上调控

③转录后RNA加工过程和运送中的调控

④翻译水平上的调控

⑤翻译后的控制

⑥mRNA降解的控制

真核基因表达调控的几个环节

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6.2.2 从酵母到哺乳动物转录调节的保守机制

6.2.2.1 活化子的DNA结合与激活功能的分离

Gal4以二聚体的形式与DNA上一段17bp的位点结合。该蛋白的DNA结合区与激活区是分离的。

Gal4与DNA上位点的结合

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酵母GAL1基因的调节序列

GAL1 的上游序列(UASG)有4个位点,每个位点与一个Gal4二聚体结合。

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域交换实验

  • 没有激活域,Gal4的DNA结合域仍能结合DNA,但是不 能激活转录。
  • b. Gal4激活转录不依赖于其特异的DNA结合域。
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6.2.2.2 真核细胞调节蛋白使用一系列DNA结构域

6.2.2.2.1 同型结构域蛋白质

由三段α-螺旋组成,其中两段(螺旋2和3)螺旋形成类似于螺旋-转角-螺旋的模式

同型结构域识别DNA

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6.2.2.2.2 含锌DNA结构域

a.典型的锌指蛋白,由2个半胱氨酸和2个组氨酸残基组成,锌原子处于中部。

b.类固醇受体,由4个半胱氨酸残基组成。

锌指结构域

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6.2.2.2.3 亮氨酸拉链

a.疏水侧面相互作用。

b. 2个巨大的α-螺旋将DNA夹住。

亮氨酸拉链

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6.2.2.2.4 螺旋-环-螺旋

螺旋-环-螺旋模体

6.2.2.3 激活域结构的不确定性

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6.2.3 通过活化子募集基因结合的蛋白复合体

6.2.3.1 活化子募集基因转录机器

图中仅仅显示了一个活化子募集两个目标,中介蛋白和通用转录因子TFIID。其它通用转录因子或者被活化子募集,或者被中介蛋白/通用转录因子TFIID募集。

在真核细胞中活化子通过募集转录机器激活转录开始

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6.2.3.2 活化子也募集核小体修饰物,以帮助转录机器结合到启动子上

机器与启动子的结合 的局部结构,介导转录 活化子直接改变染色质

a. 活化子通过募集组蛋白乙酰化酶对组氨酸残基(标有小旗)进行乙酰化,导致核小体结构的松弛;b. 活化子募集染色质重构复合体,改变启动子附近的核小体结构。

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6.2.3.3 远距离作用:DNA环和绝缘子

a. 与增强子结合的活化子对启动子的激活。b. 绝缘子位于增强子和启动子之间,当适当的蛋白与之结合后,尽管活化子和增强子结合,活化子对启动子的作用仍被阻断。c. 活化子能够激活附近的另外一个启动子。d. 启动子能被下游的另一个增强子激活。也就是,说无论是活化子还是启动子,都不会因绝缘子而失活。

绝缘子阻止增强子的活性

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6.2.4 信号整合与组合的控制

6.2.4.1 活化子之间协同作用促进信号整合

协同主要有以下3个方式:

a) 多个活化子募集转录机器的同一组分。

b) 多个活化子募集转录机器的不同组分。

c) 多个活化子相互帮助与所调控基因上游的位点相结合。

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6.2.4.2 信号整合实例:HO基因

在染色质中,SWI5能独立地与它的位点结合,但SBF不能。SWI5募集重塑分子和组蛋白乙酰化酶后,改变了核小体的特性,从而暴露出SBF的位点,使得SBF在启动子附近结合,从而激活基因。

对HO基因的控制

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6.2.4.3 组合控制体现真核细胞的复杂性和多样性

组合控制

两个基因都受多个信号控制。蛋白3在这2个基因中与不同的一组调节蛋白进行组合。

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6.2.5 信号转导对转录调节子的调控

6.2.5.1 信号通过信号转导途径传递至转录调节子

哺乳动物细胞MAP激酶的Ras信号转导途径

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6.2.5.2 信号调控转录调节子的多种方式

转录调节子通常不在DNA结合水平上被调控,而是通过下述两种基本方式之一被调控:

缺乏半乳糖时,Gal4能结合在GAL1基因上,但是掩蔽蛋白Gal80与Gal4的结合使其不能激活基因的转录。半乳糖的存在触发Gal80从Gal4上解离,因此转录被激活。

a) 活化区的暴露

酵母活化子Gal4被掩蔽蛋白Gal80调节

b) 信号控制转录调节子进、出细胞核

6.2.5.3 信号决定功能

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6.2.6 转录的负调控

6.2.6.1 转录抑制子的调控方式

酵母GAL1基因的抑制

当葡萄糖存在时,Mig1与位于UGSG和GAL1启动子之间的一个位点结合,通过募集Tup1抑制复合体,Mig1抑制GAL1基因的位点。

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6.2.6.2 基因沉默

6.2.6.2.1 组蛋白的脱乙酰化和甲基化介导酵母基因沉默

a. 通过与活化子重叠位点的结合,抑制子抑制了活化子对基因的结合,从而阻断基因的活化。b. 抑制子结合在活化子邻近位点,位阻后者的活化区。c. 抑制子与基因上游的位点结合,通过与转录机器的相互作用抑制转录起始。d. 通过募集组蛋白修饰酶(组蛋白脱乙酰酶)改变核小体,从而抑制转录。

真核生物抑制子的作用方式

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酵母端粒中的沉默效应

Rap1募集Sir复合体。Sir2是复合体中的一种组分,能使邻近的核小体脱乙酰化。随后,未被脱乙酰化的尾部与Sir3和Sir4结合,募集更多的Sir复合体,从而使得复合体中的Sir2能作用于更远处的核小体,这就解释了由于脱乙酰化引起的沉默效应的扩散。

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6.2.6.2.2 哺乳动物中DNA甲基化与沉默状态的基因有关

6.2.6.2.3基因表达的某些状态随着细胞分裂遗传

DNA甲基化与组蛋白修饰关闭基因的表达

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DNA甲基化模式可以通过细胞分裂得以维持

DNA被复制后,一种维持性的甲基化酶识别半甲基化的DNA,随后在其中未被甲基化的胞嘧啶上加上甲基基团。完全未被甲基化的序列不能被甲基化识别,仍然保持非甲基化状态。因此两个子代DNA双链的甲基化模式与母链完全相同。

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6.2.7 转录起始后的真核基因调节

6.2.7.1 某些活化子控制转录延伸而不是转录起始

6.2.7.2 mRNA可变剪接的调节

6.2.7.3 翻译水平上的调节

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确定果蝇性别的可变剪接的级联反应

Sxl蛋白只在雌性果蝇中表达(图的右边)。Sxl的存在是通过它对自己信使的剪接的调节来维持的。如果没有这种调节,就没有Sxl的合成,最终发育为雄性个体。Sxl还调节tra的剪接,在雌性个体中生成功能性的Tra蛋白。在Tra的作用下,dsx mRNA经过剪接后翻译的蛋白Dsx在其C端包含一段30个氨基酸的肽,能活化雌性发育的基因,抑制雄性发育的基因。

slide44

6.2.8 基因调节中的RNAi

酵母活化子Gcn4的可读框上游包含4个其它可读框(uORF),最上游的ORF1先翻译。在氨基酸饥饿时,重新启动翻译机器需要更长的时间,因此它更容易到达GCN4的ORF完成翻译过程。而当氨基酸充足时,重新启动翻译机器的工作在中间的ORF完成,没有到达GCN4就与RNA脱离,Gcn4得不到翻译。

Gcn4的翻译水平的调节

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6.2.8.1 siRNA

当dsRNA分子与细胞中引入或产生的基因同源时,siRNA切断基因的表达。首先在Dicer的作用下,dsRNA产生siRNA,siRNA接着控制RISC复合体,采用正文中描述的三种方法抑制基因的表达。

RNAi沉默