水稻 RACK1 蛋白的定位研究

1. 水稻RACK1蛋白的定位研究 姓名：甄萍萍 导师：梁建生 专业: 植物学

2. 综述 水稻是人类主要粮食作物之一，随着国民经济的发展和社会环境的改变，水稻生产受到越来越多的不利因素的限制，如病虫害、环境污染、水资源的短缺等，严重制约了水稻的高产和稳产，所以必须进行品种改良，其中一个方向就是对水稻抗旱品种的开发研究。干旱胁迫可引起植物细胞一系列形态和生理生化响应，植物经过长期的进化，形成了一系列主动响应干旱胁迫的机制。植物细胞通过感受外界刺激将胞外信号转化为胞内信号，进而调控相关基因表达，响应外界刺激。G蛋白偶联信号转导系统是重要的细胞信号转导途径，参与许多重要生命活动的调节响应，该系统中的G-蛋白就参与了植物响应干旱胁迫和信号转导及基因表达等调节作用。

3. WD40重复蛋白是一个具有高度保守基序但具有多种功能的大家族。异三聚体G蛋白β亚基属于WD40重复蛋白。Dell等通过酵母双杂交的方法发现了G蛋白βγ亚基可能的新效应分子，即活性C激酶1受体(Receptor for Activated C Kinase 1, RACK1)、动力蛋白中间链和一个未知功能的蛋白质(GeneBank登陆号为AAH20044)。这些蛋白质都具有WD40重复。 RACK1在广大物种中是高度保守的；研究发现，哺乳动物和植物中都存在RACK1同源物的踪迹，如猪、非洲爪蟾、鼠、大豆、山毛榉等。Chen JG等(2006)在分析鱼、昆虫和真菌的EST数据库和基因组时均发现了RACK1同源物。植物中第一个被发现的RACK1同源基因是烟草BY-2悬浮细胞中的一个生长素诱导基因arcA，之后在拟南芥、水稻、烟草、番茄、苜蓿和藻类中都发现了RACK1同源基因的存在。烟草和番茄中至少有两种RACK1同源物。

4. 报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选转化体。报告基因是一种编码可被检测的蛋白质或酶的基因，也就是说，是一个其产物非常容易被鉴定的基因。把它的编码序列和基因表达调节序列融合形成嵌合基因，或与其他目的基因相融合，在调控序列控制下进行表达，从而利用它的表达产物来标定目的基因的表达调控，筛选转化体。 目前研究中曾用过的报告基因有:β-半乳糖苷酶 (β-Lac ) ,氯霉素乙酸转移酶(CAT)、新霉素乙酞转移酶(NPII)、荧光素酶(Lux)、和β-葡萄糖苷酶(β-GUS )等。但这些传统的报告基因有着许多的不足。GUS基因所用的检测底物成本较高，且会对细胞造成毒害，染色中的一些物理，化学步骤会损伤细胞的超微结构，其中间反应的扩增也会影响葡萄糖苷酶本身的在细胞内的准确定位;以荧光素酶基因作报告基因检测时需加入荧光素，荧光素可在机体内随质流移动，使其往往难以准确地指示荧光素酶基因的特异性表达部位;而β-半乳糖苷酶基因作报告基因需要外源底物X-gal和诱导物IPTG的参与，故成本高，且操作繁琐。新霉素、氯霉素基因作报告基因的编码产物对转基因个体的幼胚存在一定的毒副作用。

5. 绿色荧光蛋白(GFP)是存在于发光水母体内，它是一种吸收蓝光或紫外光后发出绿色荧光的天然蛋白质。这种蛋白质在表达时可自身催化形成荧光基团，而且不需要添加任何底物或辅助因子，这样它就可以免除在检测时底物对细胞造成的一些物理、化学损伤，降低了添加的辅因子在对转基因个体进行观察时造成的假象，同时又降低了检测成本，简化了繁琐操作。绿色荧光蛋白(GFP)是存在于发光水母体内，它是一种吸收蓝光或紫外光后发出绿色荧光的天然蛋白质。这种蛋白质在表达时可自身催化形成荧光基团，而且不需要添加任何底物或辅助因子，这样它就可以免除在检测时底物对细胞造成的一些物理、化学损伤，降低了添加的辅因子在对转基因个体进行观察时造成的假象，同时又降低了检测成本，简化了繁琐操作。 因此，在转基因研究中，利用GFP作报告基因则可以大大提高转基因动、植物的成功率，减少转基因个体筛选、鉴定方面的工作量。

6. 植物基因工程的基本路线 (1) 目的基因的分离 (2) 将目的基因克隆到适当的载体DNA中形成重组DNA，并且连接了一个控制目的基因转录表达的启动子和一个控制目的基因转录终止的终止子，还连接一个编码特殊蛋白质（如荧光蛋白）的标记基因。 (3) 利用细菌繁殖扩增重组DNA。 (4) 利用基因枪、农杆菌等方法将连接了启动子和终止子的目的基因导入到目标植物的细胞中。 (5) 筛选含有外源基因的转化细胞，并诱导产生转基因植株。 (6) 大规模种植转基因植物。

7. 选题意义 对拟南芥AtRACK1的研究表明，AtRACK1参与了植物对干旱胁迫信号的响应过程，并且与植物的忍耐干旱密切相关。与AtRACK1蛋白的氨基酸序列为模板对水稻基因组序列进行比对，我们找到两个与编码ATRACK1基因高度同源的基因（NP-916988和XP-475866）。在蛋白质水平两者与ATRACK1蛋白的同一性和相似性分别达到70%和80%。推测水稻的RACK1（OsRACK1）可能与拟南芥RACK1（ATRACK1）具有相似的功能。

8. 本实验室以往的研究虽然证明rack1基因影响植物忍耐干旱的能力，通过研究水稻rack1过表达植株及突变体植株得知，OsRACK1与水稻抗旱能力成正相关，但对其机理不是很清楚。本研究试图从OsRACK1基因产物在细胞中的定位区域来探讨OsRACK1基因的作用机理。本实验室以往的研究虽然证明rack1基因影响植物忍耐干旱的能力，通过研究水稻rack1过表达植株及突变体植株得知，OsRACK1与水稻抗旱能力成正相关，但对其机理不是很清楚。本研究试图从OsRACK1基因产物在细胞中的定位区域来探讨OsRACK1基因的作用机理。

9. 研究方案 实验采用与gfp构建融合基因，用荧光显微镜观察的方法进行OsRACK1 的定位研究。 为了了解OsRACK1的亚细胞定位，构建rack1与gfp的融合基因，将融合基因构建成表达载体，另外再构建对照载体pCAMBIA1301 -GFP。将两个表达载体转化水稻细胞进行稳定表达。使用荧光显微镜观察GFP的绿色荧光来确定OsRACK1的亚细胞定位。

10. 研究技术路线 目的基因rack1载体 转基因表达载体的构建 报告基因gfp载体 植物表达载体转化根癌农杆菌 转基因水稻的 亚细胞定位检测 根癌农杆菌介导的水稻转化

11. 具体方法 （1）表达载体的构建 ① rack1目的基因的克隆（T-A克隆） ② gfp基因的克隆（T-A克隆） ③ pCAMBIA -RACK1 -GFP融合基因表达载体和对照载体pCAMBIA -GFP的构建 用Kpn1和BamH1酶切rack1基因，用Spe1和Kpn1酶切gfp基因，将两者插入至pCAMBIA1301 的BamH1和 Spe1酶切位点，构成重组质粒，即融合基因表达载体。

12. (2)植物表达载体转化根癌农杆菌 EHA105 采用冻融直接转化法，将构建好的植物表达载体pCAMBIA -RACK1 -GFP和 pCAMBIA –GFP直接转入根癌农杆菌EHA105。

13. 转化子在卡那霉素(100mg/mL) 的抗性LB固体培养基上筛选。随机选取转化得到的克隆，取菌液进行PCR扩增验证表达载体是否己转入根癌农杆菌中。

14. （3）转化水稻 根癌农杆菌与水稻悬浮细胞共培养，在潮霉素和头孢的双抗性N6D2培养基上筛选转基因细胞。 （4）转基因水稻的亚细胞定位检测 用荧光显微镜对转基因水稻细胞进行荧光观察

15. 实验可行性分析 1. 本实验室多年从事水稻抗旱生理生化及分子生物学的机理和拟南芥植物的分子遗传学和信号转导机制及植物研究，对相关领域的研究现状和发展趋势有深刻认识，熟练掌握了本实验所涉及的实验技术和手段，尤其水稻转基因技术，蛋白质相互作用分析技术等。

16. M 1 2 1000bp 2. 现已成功从水稻中克隆出OsRACK1基因（附图1），gfp全长基因（附图2）也已获得并测序成功，相应表达载体本实验室也有保存。 附图1： rack1的克隆PCR鉴定图

17. 附图2： M 1 2 3 4 750bp gfp克隆的PCR鉴定图

18. 3. 本实验所采取的技术路线是过去多年研究的基础上建立的，所涉及的实验方法、关键技术等也是实验室的常规方法，并且相应的仪器设备较齐全。

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21. 报告结束 谢谢！