水稻 osRACK1 蛋白的 表达纯化及功能研究

1. 水稻osRACK1蛋白的表达纯化及功能研究 姓名：曹丹丹 导师：梁建生

2. 一、研究意义 • 拟南芥G蛋白的β亚基参与了多种的细胞信号转导过程。对RACK1蛋白和G蛋白的β亚基氨基酸序列进行比对发现两者具有很高的同源性(大于87%)，并且两者具有类似的空间结构。从拟南芥中筛选到的rack1突变体具有较高的耐逆性，也暗示着RACK1蛋白可能参与渗透胁迫信号转导过程，水稻的RACK1(OsRACK1)可能与拟南芥RACK1(AtRACK1)具有相似的功能。

3. 通过本实验来证明水稻的RACK1(OsRACK1)在抗逆境胁迫中的功能，为培育高产水稻品种提供理论依据。通过分子遗传学和转基因手段，阐明RACK1蛋白在水稻响应逆境胁迫过程中作用的分子机理及其在水稻抗逆中的作用。通过本实验来证明水稻的RACK1(OsRACK1)在抗逆境胁迫中的功能，为培育高产水稻品种提供理论依据。通过分子遗传学和转基因手段，阐明RACK1蛋白在水稻响应逆境胁迫过程中作用的分子机理及其在水稻抗逆中的作用。

4. 二、研究内容及目标 １、OsARCA1基因过表达和表达受抑制的转基因水稻株系的纯和体的筛选鉴定，以及转基因水稻在干旱和盐胁迫中的生理功能分析，阐明OsRACK1基因在植物抗逆境中的作用。 ２、表达OsRACK1蛋白，测定转基因水稻中OsRACK1蛋白的表达量，研究OsRACK1蛋白与其它蛋白的相互作用。

5. 三、拟解决的关键问题 • OsARCA1基因过表达和 • 表达受抑制的转基因水稻 • 株系的构建和转基因植株 • 的筛选，这是阐明在逆境 • 胁迫条件下OsARCA1基因 • 作用及其机理的关键。

6. 四、研究方案 转基因水稻 纯和体的鉴定 GUS和潮霉素 的抗性检测 转基因水稻在 干旱和盐胁迫中 的生理功能分析 OsRACK1蛋白 的诱导表达 蛋白的纯化 抗体的制备 Western杂交 OsRACK1蛋白与 植物其它蛋白 的相互作用分析 转基因水稻中 OsRACK1蛋白 的表达量的检测

7. 五、可行性分析 １、本实验室长期从事水稻抗逆生理生化及分子生物学的机理研究和拟南芥植物的分子遗传学和信号转导机理研究，并且已经构建OsARCA1基因过表达和表达受抑制的转基因水稻株系。

8. ２、本实验所涉及的实验方法、关键技术等是目前实验室的常规方法。并且实验室具有完成实验所需要的各种仪器，如PCR仪，紫外分光光度计，各种分离纯化层析柱等。２、本实验所涉及的实验方法、关键技术等是目前实验室的常规方法。并且实验室具有完成实验所需要的各种仪器，如PCR仪，紫外分光光度计，各种分离纯化层析柱等。

9. 六、研究进展 1、水稻的种植 T1代种子经GUS检测筛选出没有性状分离的种子种于大田，按每个品种100棵种植，采取单株收割的方法收取T2代种子以便测定纯和体。

10. ２、蛋白的表达 rack1基因与GST 载体的构建 　转入BL21大肠杆菌感受态细胞 　卡那霉素抗性培养基培养过夜 　菌落PCR检测 　得到阳性菌落 　含Amp的液体培养基培养 ITPG诱导表达RACK1蛋白 　SDS-PAGE电泳检测表达的蛋白 　蛋白纯化

11. 诱导条件 • 构建载体的细胞在含Amp液体培养液中37℃，200rpm培养3-4个小时，使细胞充分分化。 • 菌体达到一定浓度加入ITPG诱导表达RACK1蛋白，28℃，120rpm培养3-4小时。

12. 不同诱导时间的电泳图 1 2 3 4 5 6 97.4KD 66.2KD RACK1/GST 融合蛋白(66kD) 43KD 31KD 20.1KD 14.4KD 时间从左到右分别为：1h 2h 3h 4h 5h 6h 结果表明融合蛋白在4h时达到最大值

13. 上清和沉淀中蛋白含量的电泳图 1 2 1号泳道为破碎上清 2号泳道为沉淀

14. 加入ITPG量不同的电泳图 1 2 3 4 5 6 IPTG浓度从左到右分别为：0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 mol/ml 结果表明pGEX-6P-1/ AtRACK1融合蛋白和pET32a融合蛋白表达量不随IPTG浓度变化

15. 经过谷光甘肽柱纯化后的电泳图 1 2 3 4 1和3号为没有结合的蛋白 2和4号为pGEX-6P-1/ AtRACK1融合蛋白

16. 谢谢大家， 请批评指正！