mikroorganismu g nu in enierija n.
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Mikroorganismu gēnu inženierija PowerPoint Presentation
Download Presentation
Mikroorganismu gēnu inženierija

Loading in 2 Seconds...

  share
play fullscreen
1 / 51
Download Presentation

Mikroorganismu gēnu inženierija - PowerPoint PPT Presentation

derek-powers
169 Views
Download Presentation

Mikroorganismu gēnu inženierija

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. Mikroorganismu gēnu inženierija 14. lekcija Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  2. Ekspresijas vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  3. Ekspresijas vektori Izmanto svešu gēnu produktu - proteīnu - iegūšanai 1. Var iegūt lielus proteīna apjomus, no dabā maz ekspresētiem gēniem; 2. Iespējams iegūt proteīnus, kādi dabā nepastāv, ienesot tajos aminoskābju izmaiņas, veidojot jaunus vai himērus proteīnus; 3. Iespējams producēt proteīnus medicīnas vajadzībām (peptīd-hormoni, interferoni, interleikīni, vakcīnas, enzīmi). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  4. Ekspresijas vektori E. coli Gēnu ekspresija E. colišūnās. Priekšrocības: • Ātri aug un efektīvi sintezē proteīnus; • AudzējotE. coli iespējams iegūt pat līdz 50 g šūnu (sausais materiāls) no 1 L barotnes; • Rekombinantie proteīni var veidoties pat līdz 50% no kopējās šūnas proteīnu masas; • E. coli barotnes ir salīdzinoši lētas un daudzveidīgas Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  5. Ekspresijas vektori E. coli Trūkumi: • E. coli ekspresētiem svešiem proteīniem nepiemīt visas vajadzīgās proteīnu post-translācijas modifikācijas: - glikozilēšana, -fosforilēšana, - savādāk veidoti disulfīu (S-S) tiltiņi, Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  6. Ekspresijas vektori E. coli Trūkumi: • E. coli ekspresētiem proteīniem ne vienmēr piemīt nepieciešamā proteīna telpiskā struktūra; • No E. coli izdalīti proteīni var saturēt toksiskus lipopolisaharīdus un dažādus alergēnus; Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  7. Ekspresijas vektori E. coli Trūkumi: • Ekspresētie proteīni (citu organismu, neadekvāti lielās devās) var izrādīties toksiski E. coli šūnām un tādēļ to ekspresijai nepieciešamas meklēt citus saimniekorganismus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  8. Ekspresijas vektori Papildus parastajām plazmīdu vektoru sastāvdaļām ekspresijas vektoriem nepieciešami: - spēcīgs promoters klonētā gēna transkripcijai, - labi regulējams (represējams / inducējams vai aktivējams) promoters, - labi mRNS transkripcijas terminatori, Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  9. Ekspresijas vektori Papildus parastajām plazmīdu vektoru sastāvdaļām ekspresijas vektoriem nepieciešami: - translāciju regulējošas nukleotīdu secības (Shine-Dalgarno secības jeb ribosomu saistīšanās vietas, RBS); - restrikcijas saiti, kas atļauj veikt DNS klonēšanu visos iespējamajos"nolasīšanas rāmjos". Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  10. Ekspresijas vektori Plašāk pielietotie promoteri rekombinantu gēnu ekspresijai E. coli šūnās: • lac promoters; • trp promoters - E.coli triptofāna biosintēzes operona struktūrgēnu transkripcijas promoters; • tac promoters - trp un lacUV5 promotera hibrīds; Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  11. Ekspresijas vektori Plašāk pielietotie promoteri rekombinantu gēnu ekspresijai E. coli šūnās: • l PL promoters - viens no l fāga agrajiem promoteriem; • dažādi pilnībā sintētiski promoteri. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  12. lac promotera vektori lac promoters tiek regulēts gan pozitīvi, gan negatīvi. Negatīvā regulācija. lac represorproteīni (LacI) saistās pie saviem 3 operator-saitiem O1, O2, O3. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  13. lac promotera vektori Represora pesaistīšanās izmaina promotera telpisko struktūru un novērš transkripciju. LacIproteīnus inducē laktoze vai IPTG. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  14. lac promotera vektori Pozitīvā regulācija Inducētu lac promoteru var papildus aktivēt vai pilnībā inducēt katabolītu aktivētājproteīns (CAP) vai CRP- (cAMP receptorproteīns). Šūnai, nonākot enerģētiska stresa apstākļos (piemēram, samazinās pieejamās glikozes daudzums) - attiecīgi palielinās cAMP koncentrācija. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  15. lac promotera vektori cAMP --- 3'-5' ciklizētā adenozīnmonofosfāta forma, nozīmīga signālmolekula šūnās. Baktērijām - enerģētiskā stresa signāls. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  16. lac promotera vektori Pozitīvā regulācija cAMP veidojas enzīma - adenilil ciklāzes (adenilātciklāzes) darbības rezultātā (cya gēns). Pieaugot cAMP koncentrācijai, tas sāk aktīvi saistīties ar CAP proteīniem. Savukārt cAMP kompleksam ar CAP piemīt transkripcijas aktivatora īpašības - tas mijiedarbojas ar daudzu operonu / gēnu promoteriem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  17. lac promotera vektori Šo signāl molekulu uzdevums - izdevīgākā enerģijas avota - glikozes - trūkuma gadījumā aktivēt iespējamos, alternatīvos enerģētisko substrātu ieguves ceļus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  18. lac promotera vektori CAP (CRP) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  19. lac promotera vektori lac promoters ekspresijas vektoros satur tikai O1, O3 un CAP saitu (CBS). Lai nodrošinātu inducējamu svešu gēnu ekspresiju arlac promotera palīdzību, nepieciešama baktēriju līnija, kas labi ekspresēLacI (hromosomāls vai episomāls gēns). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  20. lac promotera vektori Baktēriju celmam jābūt arī crp+ un cya+, lai nodrošinātu lac promotera pietiekamu aktivāciju pēc indukcijas. Crpuncyagēni kodē attiecīgicAMP receptorproteīnu un adenilātciklāzi. lacUV5 promoters satur mutāciju, kas padara to neatkarīgu no cAMP-CAP aktivācijas. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  21. lac promotera vektori pUC grupas plazmīdas satur lac promoteru un tās ir iespējams izmantot kā ekspresijas vektorus 1. pUC plazmīdu MCS polilinkerī var klonēt gēnu tādā veidā, lai tā orientācija sakristu ar lac promotera transkripcijas virzienu un lai gēna translācijas rāmis sakristu ar LacZa polipeptīda translāciju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  22. lac promotera vektori 2. pUC plazmīdu MCS polilinkerī var klonēt gēnu tā, lai tā orientācija sakristu ar lac promotera transkripcijas virzienu, bet translācijas regulācijai izmantot paša gēna ribosomu saistīšanās vietas un ATG kodonu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  23. lac promotera vektori Svešu gēnu ekspresija pUC plazmīdās: 1. Gēna klonēšana pUC MCS pareizā orientācijā; 2. Rekombinantās plazmīdas ievadīšana saimniekšūnās, kas ekspresē LacI un cAMP-CAP; 3. Plazmīdas saturošo šūnu biomasas saaudzēšana apstākļos, kad lac promoters ir represēts (LacIq); Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  24. lac promotera vektori Svešu gēnu ekspresija pUC plazmīdās: 4. lac promotera indukcija ar IPTG un aktivācija ar cAMP-CAP; 5. Gēna transkripcija un translācija, proteīna produkta uzkrāšanās šūnā. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  25. trp promotera vektori Triptofāna promoters nosaka 5 trp biosintēzes operona struktūrgēnu transkripciju. Promoteru negatīvi regulē triptofāna represors TrpR. Operonu inducē triptofāna trūkums šūnā. (triptofāns ir korepresors). Līdzīgu efektu rada 3-indolil akrilskābe (IAA). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  26. trp operons t t Pr P/Otrp Gēni: trpR represors trpE trpD trpC trpB trpA trp sintēzei vajadzīgie enzīmi Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  27. RNApol. trp operons t t Pr P/Otrp trpRrepresors Pr promoters - konstitutīvs, mazaktīvs Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  28. RNApol. RNApol. triptofāns trp operons t t Pr P/Otrp Trp represors aktivējas ar korepresora - triptofāna palīdzību Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  29. RNApol. trp operons t t Pr P/Otrp Operona transkripcijas laikā darbojas arī atenuācijas mehanisms. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  30. trp promotera vektori Atenuacijas procesā notiek transkripcijas pavājināšanās, ja šūnā triptofāns ir pietiekamā daudzumā. Kā atenuators darbojas jaunsintezētā mRNS operona transkripcijas laikā. Atenuatora secības ekspresijas vektoros ir likvidētas, jo traucē iegūt pilnu operona indukciju Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  31. trp promotera vektori Triptofāna promoters tiek lietots ekspresijas vektorā pTV. pTV ir pBR322 atvasinājums, kas satur trp promoteru un trpR gēnu. Klonējot svešo gēnu vektora EcoRI saitā notiek tā transkripcija, izmantojot trp promoteru un trp operona Shine-Dalgarno (RBS) secības. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  32. trp promotera vektori R Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  33. tac promotera vektori Izveidots no lacUV5 un trp promoteriem, apvienojot trp promotera "-35" rajonu (konsensus TTGACA) un lac promotera "-10 rajonu" (konsensus TATAAT) Aptuveni 10 reizes efektīvāks nekā lacUV5 tac promoters satur LacI operatora saitu (O1) un tādējādi represējams ar lacI un inducējams ar IPTG. tac promoters ir aktīvs gramnegatīvajās Pseudomonas putidaunE. coliu.c. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  34. tac promotera vektori tac promotera pielietojums pozitīvās atlases vektoriem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  35. tac promotera vektori Par toksisko peptīdu tiek izmantots fragments no eikariotu transkripcijas faktora GATA-1, kurš veiksmīgi saistās ar E. coli hromosomas ORI un traucē tās replikāciju. Inducējot tac promoteru, var vairoties tikai baktērijas ar vektoru, kurā toksiskā peptīda gēnu sabojājis ieveitotais DNS inserts. (Negatīvā selekcija rekombinanto klonu atlasei) Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  36. l PL promotera vektori PL un PR - l fāga agrīnie promoteri. Tos negatīvi regulē l represors - cI gēna produkts. Represoram cI ir iegūta temperatūras jutīga mutācija cI857 - represors ir aktīvs pie 28o C, bet 42o C temperatūrā, tas nespēj saistīties pie operatora saitiem. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  37. l PL promotera vektori l fāgā represors cI nodrošina lizogēno attīstības ciklu, jo nomāc agro gēnu promoterus PL un PR, kuru transkripcija ierosina fāga lītisko attīstības ciklu. Ekspresijas vektoros represoru var kodēt gan pati ekspresijas plazmīda, gan noteiktās baktēriju līnijās hromosomā insertēts gēns. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  38. pQE vektori Plaši izplatīta ekspresijas plazmīdu vektoru sērija ir pQE, kuras izplata firma QIAGEN pQE vektorplazmīdas cēlušās no maza kopiju skaita pDS plazmīdām. pQE sērijas vektori satur: T5 fāga promotera transkripcijas sistēmu - fāga T5 promoteru, kuru transkribē E. coli RNS polimerāze, tas satur lac operatora saitus. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  39. pQE vektori lac represoru pietiekamā daudzumā piegādā otra plazmīda pREP4, kura pieder pie citas plazmīdu saderības grupas nekā pQE. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  40. pQE vektori p15A ORI Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  41. pQE vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  42. pQE vektori Starp -35 un -10 konsensussecībām, kas atrodas 17 nt attālumā viena no otras, atrodas lacoperatora saits, kas nodrošina promotera represiju. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  43. pQE vektori pQE30 vektors satur nukleotīdu secības, kas kodē 6 His atlikumus. Tie izmantojami ekspresētā proteīna izdalīšanai ar metāl-afinās hromatogrāfijas palīdzību, un RGS-His epitopu (RGSHHHH), kas izmantojams ekspresētā proteīna noteikšanai ar RGS-His antivielu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  44. pQE vektori Nitrilo triacetāts veido 4 koordinācijas saites ar Ni2+ joniem Proteīna molekulā blakus izvietotu histidīna atlikumu imidazola gredzenu N atomi veido koordinācijas saites ar Ni2+ joniem Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  45. pQE vektori Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  46. pQE vektori Proteīnu ekspresijas shēma pQE vektoros: Gēna klonēšana izvēlētajā pQE vektorā (N- vai C-gala His atlikumi, iespējama koekspresija ar DHFR fragmentu). DHFR - peles dihidrofolāta reduktazes gēna fragments. Aizsargā proteīnu pret noārdīšanu, pašam maza imunogenitāte. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  47. pQE vektori Klonēšanu veic baktērijās, - kas jau satur pREP4 (LacI ekspresijai), vai arī - baktēriju līnijā, kura satur lacIq mutāciju (pastiprināta LacI ekspresija), piemēram, TG1. Klonējot jāņem vērā rekombinantā gēna nolasīšanas rāmis, tā, lai tas sakristu ar 6xHis nolasīšanas rāmi. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  48. pQE vektori Rekombinantu atlasi var veikt izmantojot - restrikcijas analīzi vai arī - rekombinantā gēna ekspresiju (imunoloģiski - RGS-His epitops, ekspresētais proteīns). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  49. pQE vektori Proteīnu ekspresijas shēma pQE vektoros: • Rekombinanto plazmīdu ar ekspresējamo gēnu audzē E. coli celmā, kurā atrodas pREP4 plazmīda - apstākļos, kad promoters ir represēts; Kad iegūta pietiekama biomasa, inducē promoteru (pievienojot IPTG). Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML

  50. pQE vektori • Veic šūnu līzi denaturējošos vai nedenaturējošos apstākļos. • Pateicoties His traktam rekombinanto proteīnu saista pie matrices ar Ni-NTA grupām. • Atmazgā piemaisījumus un atdala piesaistīto proteīnu. Mikrobioloģijas un biotehnoloģijas katedra ML