Elválasztás technika

1. Elválasztás technika Bartus Zsuzsanna Fodor Melinda Mahunka Marietta Marosi Dóra Németh Viktória Szabados Ádám Szabó Dávid Takács Mónika Troczkis Fruzsina Labor beszámoló M2 csoport

2. HS-GC-MS

3. HS-GC-MS • Gőztéranalizátor (headspace) – mintaadagolás • Gázkromatográf – elválasztás • Tömegspektrométer - detektálás PerkinElmer HS-GC-MS

4. Gőztéranalizátor (HS) - mintatartó • Minta (folyadék, szilárd)- és Gázfázis közt egyensúly alakul ki • Az egyensúly eltolódását a gőztér hőmérséklet változtatásával (termosztálás) tudjuk befolyásolni • Egyensúly beállta után véges térfogatot bocsájtunk a gázkromatográfba

5. Kiegyensúlyozott nyomású mintaadagolás (balancedpressure) • d=0,2-0,3 mm, kicsi holttértfogat, elhanyagolható zónaszélesítő hatás • Minta térfogat nagysága a ∆p-től és adagolási időtől függ • Zárt, minden részében jól termosztált rendszer • Paraméterek könnyen kontrolálhatók, jól reprodukálható mérések

6. Gőztéranalizátor – beállítandó paraméterek és főbb hatásaik • Gőztér hőmérséklete (max 400°C): megoszlási hányados • Termosztálási idő: megoszlási hányados • Tű hőmérséklet: kondenzálás • Átvezető cső hőmérséklete: kondenzálás • Nyomás alá helyezés ideje: mintatérfogat, kapilláris • Injektálási idő: mintatérfogat

7. Gázkromatográfia • Kromatográfia: fizika-kémiai elválasztási módszer, ahol az elválasztandó alkotók 2 fázis közt – álló és mozgó – oszlanak meg a különböző mértékű kötődéseik szerint • Gázkromatográfia: gáz halmazállapotú mozgófázis • Kolonna töltete/belső bevonata lehet az állófázis • Gázok és gőz halmazállapotúra hozható folyadékok vizsgálatára alkalmas • Az elválasztás nagyszámú szorpciós-deszorpciós lépésen keresztül történik • Az elválasztás függ a vivő gáztól (Hidrogén, Nitrogén, Hélium) • MS-nél Héliumot alkalmaznak a nagy ionizációs energiája miatt

8. Gázkromatográfia • Két kolonna típus: • töltött kolonna: töltet lehet szilikagél, aktív szén, diatómaföld…stb., 2-4 mm belső átmérő, 0,3-3 m hossz • kapilláris kolonna: belső folyadék film bevonat lehet metil-szilikon olaj, fenil-metil-szilikon olaj…stb., 0,10-0,53 mm belső átmérő, 15-75 m hossz • Elválasztás befolyásolása: • Termosztáló hőmérséklet • Hőmérséklet egyenletes, lineáris változtatása • Állófázis változtatása

9. Tömegspektroszkóp • Mérés elve: ionos részecskéket választunk el fajlagos tömegük (töltésegységre eső tömegük: m/z) szerint csökkentett nyomáson elektromos vagy mágneses mezők segítségével • Mérjük az elválasztott ionok intenzitását • Tömegspektrum (ujjlenyomat) • Minőségi információ: legintenzívebb ion intenzitásra normált karakterisztikus tömegspektrum

10. Legfontosabb készülékelemek • Mintabeviteli rendszerek (GC-MS) • Ionforrás • Analizátor • Detektor • Számítógép • Vákuumrendszer • Energiaellátó elektromos egységek

11. MS detektor

12. Előnyök • összetett elegyek minőségi és mennyiségi elemzése rövid idő alatt (20-30 perc) elvégezhető, s igen kis mennyiségű alkotók (10-15-10-21 g) meghatározása lehetséges • Minőségi,szerkezeti információ (hogyan?): • Referencia anyagot kell használni • a mérés során kapott tömegspektrum és ismert vegyületek, ismert tömegspektrumainak az összehasonlítása, • a mérés során kapott tömegspektrum "megfejtése", ismert szabályok alapján történő értelmezése

13. Scanfunkciók • Pásztázó: • az egész m/z tartományra történő ionintenzitás mérés • A különböző m/z pontoknál mért intenzitások egymáshoz való arányát is lehet látni → minőségi információ • Dinamikus üzemmód,pillanatnyi ionáramot mér,nagyobb hibával jár • SID: • Különböző, kevés m/z pontokban történő ionintenzitás mérés • Legalább 2 pontban kell mérni • Az adott mérések csak pár m/z pontra korlátozódnak, így a kérdéses ionokról sokkal pontosabb mérési eredményeket kapunk → mennyiségi információ • Kimutatási határ 1 nagyságrenddel jobb

14. FID (lángionizációs detektor) kb. 2000-2500 K hőmérsékletű hidrogén-levegő láng A lángban a C-H kötéseket tartalmazó molekulák, azaz a szerves vegyületek (pl szerves savak) fragmentálódnak és egy részük ionizálódik Láng fölé helyezett elektródpár között gyenge áram folyik ionok képződésének hatására jel (feszültséget mér) (mintakomponens koncentrációjával arányos) Standardek használata

15. HS-GC mérésgyakorlat • Mérés célja: Melaszban lévő karbonsavak vizsgálata. • Vizsgált minták: C2, V2 • Felhasznált vegyszerek: 85%-os foszforsav, NaCl (Merck, Darmstadt), több komponensű kereskedelmi standard (minden komponens 10 mmol/l)

16. Gőztéranalizátor (HS) paraméterei • Minta hőmérséklete: 60 °C • Tű hőmérséklete: 100 °C • Átvezető cső hőmérséklete: 150 °C • Termosztálási idő: 10 perc • Nyomás alá helyezés ideje: 2 perc • Injektálási idő: 0,05 perc • Tű visszahúzás ideje: 0,5 min

17. Gázkromatográfiás készülék adatai • Készülék: Perkin Elmer AutoSystem XL • Detektor: FID • Vivőgáz: N2, 110 kPa • Adagoló: Perkin Elmer Headspace Sampler • HS 40 • Kolonna: VOCOL 60m x 0,53 mm x 3 μm • Hőmérsékletprogram: 50 °C – ról 200 °C – ig • 7 °C/perc sebességgel

18. A standardek és a minták előkészítése • Légmentesen záródó 20 ml-es üvegedénybe • bemértünk 2g NaCl-ot (kisózás), majd 1 ml foszforsavat • adtunk hozzá. • Erre mértük rá automata pipettával a standard/minta • 1 ml-es részletét. Közvetlenül ezután • az edényt gyorsan légmentesen lezártuk.

19. Standard kromatogramja

20. C2-es minta kromatogramja

21. V2-es minta kromatogramja

22. Mérési eredmények • A C2-es mintában azonosított komponensek: propionsav, izovajsav, izovaleriánsav, izokapronsav, kapronsav • A V2-es mintában azonosított komponensek: propionsav, izovajsav, vajsav, izovaleriánsav

23. GyorsLC

24. Kromatográfia általánosan • Többfokozatú, nagyhatékonyságú, dinamikus elválasztási módszerek gyűjtőneve. • Közös elem: az elválasztandó komponensek az egymással érintkező két fázis között oszlanak meg, ezek közül az egyik áll, a másik pedig meghatározott irányba halad.

25. UHPLC (UPLC) HPLC • 8x, 10x gyorsabb • p›1200-1300 bar • Dp‹2-3 µm; héjszerű szemcse • L= 3-10 cm; 2-3 mm • 0,1-0,5 µl minta térf. • UV-VIS • p<400 bar • Dp= 3-10 µm, porózus, nem porózus • L= 15-25 cm; 3-8mm • 5-200 µl • UV-VIS

26. Alapösszefüggések a kolonnán kívüli zónaszélesedésre optimált gyors LC és HPLC módszereknél • Kis szemcseátmérő • Kis térfogat (kisebb holttérfogat, kisebb komponens hígulás) • Elemzési idő csökk.: L csökk., u növelése (k nem- interferencia veszély)  meg kell növelni p-t (Darcy)

27. Szemcse sérülése (UHPLC nagyobb nyomás) • Kis η mozgófázis  acetonitril tartalmú (gradiens elúció, maximumos görbe) • H csak kis mértében nőjön u-val (függ η) • Készülék max nyomás  sebességnövelés határa • Nagy nyomáshőhossz-, keresztirányú hőm.-grad. széles torzult csúcs (belső átmérő csökk.) • belső átmérő csökk.Vr csökk. külső zónaszélesítő hatások

28. Kromatográfia kinetikus elmélete: • van Deemter egyenlet: • H- elméleti tányérszámmal ekvivalens oszlopmagasság, u-mozgófázis lineáris áramlási sebessége • A: az oszlop geometriájának hatása (szemcsék közti tér nem teljesen rendezett) • B: longitudinális diffúzió (molekula áramlik a szemcsék között) • C: anyagátadással szembeni ellenállás

29. Kromatográfia kinetikus elmélete: • Szemcseátmérő csökkentése: élesebb csúcs, rövidebb, kisebb átmérő

30. Kromatográfia kinetikus elmélete: • Hőmérséklet növelésével:csökken a kölcsönható erők viszkozitása (mozgófázis), nő a mérendő komponens diffúziós állandója. B≈DM (molekuláris diffúziós állandó); C≈ (póruson belüli diffúziós állandó) • Kis szemcsén belüli átmérő, a mozgófázis áll, csak a részecske diffúzióját vizsgáljuk.

31. Kromatográfia kinetikus elmélete: • Nyomás növelése: a szemcseátmérő csökkentés velejárója, lamináris tartomány • Héjszerkezetű állófázis: a diffúziós úthossz rövidebb, mint egy teljesen porózus szemcsénél. • Kolonna ellenállását csökkenteni, mozgófázis gyorsabb, nem töltetes, hanem monolit kolonna esetén. Egy nagyságrenddel kisebb nyomás, mint a porózus töltet esetén. Könnyebben alakul ki nagyobb sebesség. • Nyomástartomány és az oszlopon kívüli térfogat nagyon fontos.

32. UPLC készülék paraméterei • WatersAcquity, Ascentis Express Peptide ES • 10 cm x 3 mm; 2,7 µm (0,5 µm tömör belső) • Gradiens elúció • Eluens (30 % B-ig mentünk fel): A: víz+0,1 % TFA; B: acetonitril:víz+0,1 % TFA (= 90:10) • U=0,8 ml/min, beinj.: 2 µl, • Detektálás: λ=260 nm

33. Mérés kiértékelés • Mennyi komponenst tud meghatározni? Pc=1+tg/wb (tg= 2.5 min alatt)  Pc= 41

34. Korlátok a gyors folyadékkromatográfiás módszereknél

35. Korlátok a gyors folyadékkromatográfiás módszereknél • Azt vizsgáljuk, hogy milyen követelmények vannak műszer oldalról nézve az elemzés gyorsaságának növelésére. • A kromatogramon mért zónaszélesedés két fő részből tevődik össze: • Kolonna által okozott • Kolonnán kívüli zónaszélesítő hatások • Adagoló okozta zónaszélesedés σ2A • Összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö • Detektorcella okozta zónaszélesedés σ2Dcell • Detektor elektronika okozta zónaszélesedés σ2Dt • σ2E = σ2A+σ2Ö+σ2Dcell+σ2Dt • ∑σ2= σ2C+ σ2E

36. Az adagolóban és az összekötő vezetékben azért van zónaszélesedés, mert az áramlás lamináris és a sebességi profil parabolikus, az egyes rétegek közötti keveredés elhanyagolható. Azok a molekulák, amelyek a cső falához közelebb vannak kb fele sebességgel haladnak, mint a maximumban lévők => áramlási csúcsdiszperzió Ehhez hozzájárul a detektorban az áramlási sebesség megváltozása: ha lassú az elektronika, akkor nem lehetséges legalább 20 adatpont gyűjtése, amiből a kromatográfiás csúcs analóg jele leképezhető =>változik a görbe alatti terület és a zónaszélesség. A zónaszélesedés összege nem lehet nagyobb, mint a kolonnán mért tizede. σ2E=0,1σ2C

37. Példa UPLC: 5 cm hosszú, 2,1 mm belső átmérőjű kolonna, 1,7 µm szemcseátmérőjű töltet Kolonna okozta zónaszélesedés: σ2k=(πr2εT)2HL UPLC: σ2k=8,14 µm A komponens hígulása a kolonnán kicsi és a csúcskapacitás nagy, mert szűk a zóna, viszont a kolonnán kívüli zónaszélesedést meghatározza. A 10 %-os szabályt betartva a kolonnán kívüli zónaszélesedésnek 1 µl alatt kell lennie. Ez pedig több függetlenből tevődik össze, meg kell adni az egyes tagok járulékait: - megengedett legnagyobb injektált térfogat Vinj=105 nl - Detektor okozta zónaszélesedés és detektor térfogat σ 2det=20,8 µl - összekötő vezeték okozta zónaszélesedés σ2Ö=1,28 µl*1280 nl - detektor időállandó τRC=0,17 sec r=2,1 cm εT=0,5 Dp=1,7 µm H= 3,4 µm L=5 cm

38. Mintavételezési sebesség hatása a csúcskapacitásra és a felbontásra: a csúcskapacitás összefügg a kromatográfiás felbontással, így ha a csúcskapacitás csökken, csökken a felbontás is. Mintavételi sebesség Csúcskapacitás 80 Hz 40 Hz 20 Hz 10 Hz 5 Hz 61 56 44 28 16 HPLC A lassú mintavétel jelentősen csökkenti a kromatogramon látható csúcsok számát 80 Hz 40 Hz 20 Hz 10 Hz 5 Hz 2,25 2,05 1,71 1,17 0,67 UHPLC A gyors kolonnák nagy mintavételi frekvenciát igényelnek A kis belső átmérőjű és rövid kolonnákhoz a hagyományos HPLC rendszer nem, vagy csak nagy hatékonyság csökkenéssel alkalmazható.

39. Rövid kolonnák alkalmazása HPLC rendszerben: - 5 µl jelenti az adagolás felső határát - a minta oldószerének gyengébbnek kell lenni, mint a mozgófázis eluenserőssége - a molekuláris formának azonosnak kell lennie a mintában és a mozgófázisban - az összekötő vezetékek hosszát a készülék által megadott minimumra kell csökkenteni Adagoláskor a kolonna elején csúcskompresszió történik => gradienselúciót alkalmazunk akkor is, amikor nem lép fel az általános elúciós probléma. A kiindulási mozgófázis összetételének olyan gyengének kell lennie, hogy a minta leggyengébben visszatartott komponensének is nagyobb kell, hogy legyen a visszatartása, mint 10. Visszatartási tényező: K= KVs/Vm=ns/nm*Vs/Vm Vs, Vm: álló- és mozgófázis térfogata K: megoszlási hányados ns, nm: álló- és mozgófázisban mért mólok száma

40. k>10 A komponensek döntő részben az állófázisban tartózkodnak. Az összes komponens vándorlási sebessége lecsökken, a mintaadagolás során a kolonna eleje koncentrálja azokat. Vándorlási sebesség [ux=u/(1+k)] csökken. k=10 Tizenegyed részére csökken a vándorlási sebesség, így a komponensek szűk zónában koncentrálódnak. Itt problémát okozhat az oldhatóság, ha a minta komponenseinek nagyon eltérő az apolaritása vagy polaritása. Ekkor a jobban visszatartott komponensek a gyenge eluenserősségű mozgófázisban kevésbé oldódnak. A közel egyforma tulajdonságú vegyületeknél a szelektivitás csökken.

41. Az elválasztást befolyásoló paraméterek hatásának vizsgálata

42. A kromatográfiás felbontás alapösszefüggése • Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k) • N az elméleti tányérszám (kinetikai hatékonyság), • α a relatív retenció vagy szelektivitás (termodinamikai hatékonyság), • k a visszatartási tényező. • A kromatográfiás rendszerekben az elválasztás ezen három paramétertől függ.

43. Hogyan befolyásolja a paraméterek megváltoztatása az elválasztást? • Deriváljuk az elválasztást megadó Rs = N ½ (α – 1/α)(k+1/k) összefüggést, mindig az adott vizsgálandó paraméter (N, α, k) szerint.

44. 1.) Elméleti tányérszám hatása • ΔRs/ΔN = 1/8(N½)(α-1/α)(k/(k+1)) • Egységnyi N változás  0,0144% elválasztás-változás. • Ha a kolonnahosszat 2x-esére növeljük (pl. N = 3000-ről 6000-re)  az elválasztás értéke kb. 14%-kal nő (ha ua. a kolonna és változatlan a mozgófázis összetétele). • Ez a hatás kismértékű, tehát a kolonnahossz növelése csak mérsékelten növeli az elválasztást. • A nyomásesés a kolonnán közben kétszeresére nő. • Ezek az adatok k = 2-3, α = 1,1 és ΔR = 1 körüli értékekre igazak.

45. Van Deemter  ha a szemcseátmérőt felére csökk.  az elméleti tányérmagasság is a felére csökken (Hmin és az Nmax)  N 2x-esére nő. • A H-u görbe meredeksége annál kisebb, minél kisebb a szemcseátmérő (N-ben nagyobb lesz a nyereség). • Ha 3 µm-ről 1,5 µm-re csökkentjük az állófázis szemcseátmérőjét, akkor pl. N=1000 2500-ra nő  kb. 26%-os növekedés az elválasztásban (ha az egyéb paramétereket változatlanul hagyjuk). A nyomásesés 4x-esére nő!

46. 2.) Szelektivitás hatása • ΔRs/Δα = ((N½)/4)(1/α2)(k/(k+1)) • Egységnyi változás az α-ban  közel 1000-szeres változást okoz az elválasztási tényezőben. • A szelektivitási tényező kismértékű változása nagymértékben növeli az elválasztást. • Folyadékkromatográfiában vagy az állófázis típusát változtatjuk meg (állófázis hatás), vagy a mozgófázis összetételét (mozgófázis hatás). Ahhoz, hogy a mozgófázissal a megfelelő elválasztást tudjuk elérni, szükséges, hogy az állófázison minimális elválasztás elérhető legyen. A vegyületek szerkezetének függvényében, tehát az első feladat a legnagyobb szelektivitást nyújtó állófázis kiválasztása, csak utána következhet a mozgófázissal az elválasztás „finomhangolása”.

47. 3.) Visszatartási tényező hatása • ΔRs/Δk = ((N½)/4)((α-1)/α)(1/(1+k)2) • Egy egységnyi változás k-ban  kb. 8% változást jelent a felbontásban. • A deriváltnak maximum helye van a 2-3 k érték körül. • Folyadékkromatográfiában a visszatartást az állófázis minőségével, a mozgófázis összetételével és a hőmérséklettel tudjuk változtatni.

48. Hőmérséklet • Új elválasztást befolyásoló tényező, amely a technikai megvalósításban a legutóbbi években jelent meg.

49. Monolit kolonnák

50. Elemzési idő csökken, ha a lineáris áramlási sebesség nő! tr=L/u(1+k) • Szemcsés tölteteknél a lineáris áramlási sebesség növelésével egyenes arányban nő a kolonnán a nyomásesés • Ez monolit kolonnákra is igaz, viszont ezeknek az áramlási ellenállásuk sokkal kisebb, mivel porozitása a szemcsés töltethez képest sokkal nagyobb (a kolonna térfogatának 80%-a holttérfogat) • Azaz ugyanolyan áramlási sebességhez sokkal kisebb nyomásesés tartozik (~ 1 nagyságrenddel)