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第七章遗传检测与基因治疗 陈火英办公地点：农生大楼1-301 联系电话：34206934 chhy@sjtu.edu.cn

遗传检测？ • 分子标记辅助筛选？ • 基因诊断？ • 基因治疗？ • 产前检查？ • DNA与证据? • 与DNA检测相关社会问题？

遗传检测 1 概况： • 遗传检测：对人的DNA、RNA、染色体、蛋白质或者某些代谢物进行分析，以便探测与疾病相关的基因型、突变、表现型或者染色体组型等。 • 遗传检测和传统的医学检测有两点不同： • 遗传检测结果对于病人以及病人家庭的疾病风险估计都是很有帮助的； • 遗传检测可帮助个人决定是否进行医疗保健。

遗传检测的方法 • 系谱分析（第四章） • 细胞遗传学检查 • 生物化学检查 • 基因诊断

细胞遗传学检查 • 染色体检查：进行染色体标本制备、显带、核型分析。 • 荧光原位杂交（FISH） • 生物化学检测 • 遗传病诊断中重要的辅助手段。 • 基因缺陷引起基因产物蛋白质结构和量的改变，导致细胞正常结构和功能的异常。 • 分析方法：电泳技术、氨基酸序列分析、酶动力学、免疫反应。

DNA RNA Protein Phenotype 分子标记辅助筛选？表型

分子标记及其优越性 • 分子标记 • 指能反映生物个体或种群间基因组中某种差异特征的DNA片段，它直接反映基因组DNA间的差异。 • 优越性： • 在生物体的各个组织、各个发育阶段均可检测到，不受季节、环境限制，不存在表达与否等问题； • 数量极多，遍布整个基因组，可检测座位几乎无限； • 多态性高，自然界存在许多等位变异，无需人为创造； • 不影响目标性状的表达； • 许多标记表现为共显性的特点，能区别纯合体和杂合体; • 成本不太高。

分子标记的三个阶段 • 随着分子生物学技术发展和研究水平的深入，分子标记的发展经历了三个阶段，也称为三代DNA分子标记。 • 第一代分子标记：RFLP； • 第二代分子标记：微卫星（SSR）； • 第三代分子标记：SNP；

Advanced in Molecular Markers ??? SRAP DNA Chips CAPACITY ISSR AFLPs SSRs RAPDs RFLPs 1985 1990 1995 2000

分子标记的类型和特点 • 类型（按技术特性分类） Hibridisation-based markers以分子杂交为基础的DNA标记技术（RFLP标记、DNA指纹技术、原位杂交）分子标记 PCR-based markers以PCR反应为核心的DNA指纹技术（RAPD标记、SSR标记、SSLP标记、SCAR标记、AFLP标记、STS标记） Sequencing based markers新型的分子标记（SNP标记、EST标记）

常用分子标记的类型 （一）限制性片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism，简称RFLP）（二）随机扩增多态性DNA（Random Amplified Polymorphic DNA，简称RAPD）（三）扩增片段长度多态性（Amplified Fragment Length Polymorphisms，简称 AFLP ）（四）简单序列重复标记（Simple Sequence Repeat,简称SSR）

常用分子标记特点比较

分子标记在植物育种中的应用 • 分子遗传图谱的构建； • 遗传多样性与种质鉴定; • 重要经济性状相关基因的定位 ; • 分子标记辅助选择（Marker-Assisted Selection）; • 重要经济性状的图位克隆。

重要农艺性状基因连锁标记的筛选技术 • 目标基因的标记筛选（gene tagging）是进行分子标记辅助选择（MAS）育种的基础。 • 用于MAS育种的分子标记须具备三个条件： • 分子标记与目标基因紧密连锁，一般要求两者间的遗传距离小于5cM,最好1cM或更小； • 标记实用性强，重复性好，而且能够经济简便地检测大量个体； • 不同遗传背景选择有效。

一、遗传图谱的构建与重要农艺性状基因的标记 • 遗传作图的原理其原理是基于染色体的交换与重组。在细胞减数分裂时，非同源染色体上的基因相互独立，自由组合，而位于同源染色体上的连锁基因在减数分裂前期I非姊妹染色单体间的交换而发生基因重组，用重组率来表示基因间的遗传距离。遗传图谱只显示基因间在染色体上的位置，并不反映DNA的实际长度。

构建遗传图谱的主要环节： • 根据遗传材料之间的多态性确定亲本组合，建立作图群体； • 对群体中不同植株的标记进行基因性分析； • 借助计算机程序构建连锁群。 • 构建遗传图谱，首先要选择合适的亲本及分离群体，而且亲本之间的差异不宜过大，否则会降低所建图谱的准确度和适用性。 • 用于分子标记的遗传作图可分为两类： • 暂时性分离群体，包括F2群体、BC等； • 永久性分离群体，包括重组自交系群体、加倍单倍体群体等。

不同作物群体的特点

作物MAS育种标记辅助选择（marker assisted selected ，MAS）是指与特定的数量性状相关的遗传标记为工具，以标记信息作为辅助信息，对该数量性状进行选择，以在育种中获得较大的遗传进展。分子标记辅助育种技术，借助于目标基因与某个分子标记紧密连锁，通过对分子标记基因型的检测，就能获知目标基因的基因型。利用分子标记对个体进行目标区域以及全基因组筛选，可加速回交育种进程，克服不利连锁累赘，获得期望的个体，达到提高育种效率的目的。

Line improvement for drought: MAS scheme Mapping Trait transfer (MAS) P1 x P2 P1 x CML247 BC1F1 (400) F2 (240) { { QTL Mapping Drought Low N F2 (240) QTL Mapping Drought MAS F3 (240) BC2F1 (2200) F3 (240) MAS BC2F2 (2200) MAS { BC2F3 (2200) QTL Mapping Drought RILs (220) (S6) MAS Testers BC2F4 CML 254 and 274 Field evaluations

受体供体目标基因与DNA标记间的遗传距离为p M R m r 利用 MAS 的遗传基础（以 RFLP 为例）亲本中DNA标记的带型 M—抗性标记 R—抗性基因 m—感病标记 r—感病基因 M R m r F1杂种中DNA标记的带型在F2分离群体中分子标记类型即MM,Mm,mm MM类型的分子标记所代表的目标基因型及其频率 RR Rr rr (1-P)2 2P(1-P) P2

提高分子标记的筛选效率 （一）多重PCR方法（二）用相斥相分子标记进行育种选择（三）克服连锁累赘（四）降低MAS育种的成本

标记辅助选择应用 • 设在菲律宾的国际水稻研究所已经获得了分别聚合多个抗稻瘟病和抗白叶枯病基因的水稻株系； • 美国已经把在玉米上鉴定到的与产量有关的数量性状基因座位转移到了不同的自交系中，由这些自交系组配的杂交种的产量比对照杂交种提高15%以上。 • Tinsley等(1989)通过计算机模拟，在番茄上利用分子标记进行回交选择，仅30个单株进行3代回交就选到了回交亲本类型的材料，而常规方法则需要数百个单株，回交6-8代。

MAS与表型选择的比较 • 可以进行早期选择，加快育种进度； • 区别较细微的差异，如多位点控制的数量性状，直接选择困难； • 可同时对几个性状进行选择。

MAS存在的问题 • 标记信息的丢失。标记并不是基因，由于重组使标记与基因分离，导致选择偏离方向。 • QTL定位和效应估算的不精确性。 • 上位性的存在。由于QTL与环境、QTL与QTL间存在互作，导致不同环境、不同背景下选择效率发生偏差。 • QTL筛选与育种过程相脱离。

MAS成功应用？ • 发展饱和的遗传图谱，寻找与目的基因紧密连锁的两侧标记，提高基因型与表现型的一致性。 • 从全基因组水平上对QTL展开研究，包括QTL的数目、位置、效应以及QTL与QTL间、QTL与环境的互作、QTL的一因多效性等，充分发掘QTL的信息，选择最佳组合进行标记辅助选择。 • QTL筛选与品种选育过程相结合，如选择商业品种作为作图亲本之一，或利用回交高代QTL方法将筛选与育种同步进行。 • 将常规选择与标记辅助选择相结合，针对不同性状的特点，研究高效的选择方法。 • 各研究机构的良好合作也是MAS成功应用的重要基础。

基因诊断 • 1. 基因诊断的一般概念对受检者的某一特定基因或其转录物进行分析和检测，从而对相应的疾病进行诊断。 • 2. 意义基因诊断的问世标志着疾病的诊断从传统的表型诊断步入了基因型诊断的新阶段，代表了诊断学领域的一次革命。 • 3. 内容： DNA诊断:检测特定基因的DNA序列中所存在的点突变、缺失和插入等变异情况，及特定DNA的拷贝数。分析静态的基因结构。 RNA诊断:对待测基因转录物（RNA）进行定量，检测其剪接和加工的缺陷，以及外显子的变异等等。分析动态的基因表达。

4 基因诊断的特点 • 高度特异性分子杂交等，严格的碱基配对 • 高度精确性和灵敏度同位素或其它标记技术，样品量pg级，单细胞 • 检测病原体、不受抗菌素影响; 早期诊断、产前诊断 • 基因转录活性状态

5 基因诊断常用方法 • 直接诊断 • 限制行内切酶片段长度多态性 (RFLP) • 聚合酶链反应 (PCR) • 间接诊断 • 多态性连锁分析 • DNA 芯片

基因诊断（Gene Diagnosis） • G到T一个碱基的改变，决定了一个人的命运 • 出生23个月的婴儿就出现皮疹、便血等病状，患上了罕见的原发性免疫缺陷病。 • DNA序列分析，证实了小皓珩WAS蛋白基因的1388位核苷酸由G突变为T，使编码谷氨酸的密码GAG突变为终止密码TAG。 • WAS蛋白突变为无功能的WAS蛋白，导致患儿血小板减少，淋巴细胞形态和功能异常。 • 希望：WAS目前已经可以用骨髓移植或干细胞移植根治。通过从患者体内提取样本(DNA)用基因检测方法来判断患者是否有基因异常或携带病原微生物的方法，就是基因诊断。

传统的诊断 望问听触——经验化验/检验——微生物、免疫学、生物化学、病理学等对细胞、组织、酶、代谢物等检测影像学—X线、B超、CT、核磁共振、内窥镜等特殊检查—肌电/脑电/心电、骨密度等。基因诊断应用分子生物学方法：如PCR技术或PCR与分子杂交标记。主要应用于先天遗传性疾患（苯丙酮尿症、血红蛋白病）；后天基因突变引起的疾病（肿瘤、糖尿病）；病原生物的侵入（流感、肝炎、艾滋病）；个体识别、法医物证。传统与基因诊断的比较

基因治疗（Gene Therapy） • 基因治疗是将正常的外源基因导入靶细胞中以弥补靶细胞所缺失或突变的基因、或抑制异常表达的基因。 • 目前，基因疗法的对象： • 基因病、肿瘤、心血管病、糖尿病、血友病、严重贫血、关节炎、爱滋病等15种以上疑难顽症。 • 基因治疗人类遗传性疾病,仍在探索阶段。

基因治疗的策略 原位修复(基因修复）对有缺陷的基因在原来位置上进行修复，使该基因恢复正常。基因替代疗法治疗策略是切除发生缺陷的基因，再转入有功能的正常。基因增强将目的基因导入靶细胞，目的基因的表达产物可以补偿缺陷细胞的功能。基因抑制导入外源基因以抑制原有的基因，目的在于阻断有害基因的表达。

基因治疗的基本方式 • 回体法（ex vivo） • 在体外将目的基因导入细胞内,再将这种细胞回输给病人。 • 在体法（in vivo） • 将外源基因直接导入体内有关的组织器官。

基因治疗的应用 转入功能基因（单基因遗传病） • 血友病B 薛京伦等用逆转录病毒载体将IX因子的cDNA转入血友病B患者的皮肤成纤维细胞，再回植患者皮下，患者凝血因子IX的表达明显增高，症状得到改善。 • 重症综合性免疫缺乏症（SCID） • 腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症是常染色体隐性遗传的致死性疾病，患者由于ADA缺乏导致脱苷腺氨酸增多，改变了甲基化能力，致使淋巴细胞受损，从而导致免疫缺陷。 • 1990年，首次将ADA转基因T淋巴细胞注射到人体骨髓组织（患有－－腺苷脱氨酶（ADA）缺乏症的4岁儿童），治疗SCID。

案例-地中海贫血症 • 地中海贫血的基因治疗地中海贫血是由于α与β两类珠蛋白基因表达失衡而引起的遗传性溶血性疾病，其中β地中海贫血危害较严重。地中海贫血一直是遗传性疾病基因治疗的重要目标之一。 • 世界卫生组织已将血红蛋白病(包括异常血红蛋白与地中海贫血)列为严重危害人类健康的疾病之一。据估计，全世界至少有1．5亿多人携带血红蛋白病的基因。从近20年来，我国28省、市、自治区近100万人口的流行病学调查资料来看，异常血红蛋白的发病率为0．33％，α-地中海贫血的发病率为2．64％，β-地中海贫血的发病率为 0．56％，尤其是地中海贫血，已成为我国西南与南方某些地区的严重公共卫生问题。

地贫的诊断主要依据临床表现、实验室检查和基因诊断。地贫的临床表现呈多样性，轻者本人多无自觉症状而不易察觉，常因体检时发现轻度贫血或家系分析时才诊断。重型α地贫胎儿，又称 Bart's水肿胎，因4个α基因全部缺失，α珠蛋白链不能合成，常于怀孕中期开始发病，表现为胎儿全身水肿，心脏畸形，体腔积液，胎盘巨大而水肿，多于怀孕晚期死于宫内。即使能怀孕至足月，也多于出生后数分钟内死亡，而且孕妇常合并妊高征，胎盘早剥，子痫抽搐，产时或产后大出血等产科危重并发症。另一种次严重的α地贫，又称血红蛋白H病，与重型β地贫表现相似或贫血症状稍轻，这两类地贫在胎儿期无特殊临床表现，可以怀孕至足月分娩，出生时与正常胎儿几无分别，多于生后6个月左右开始发病。表现为进行性溶血性贫血，血色素可低至2-4g/dl，肝脾肿大，脸色萎黄，苍白无力。此病目前国内外尚无有效的治疗方法，仅能依靠输血维持生命。由于极易发生各种并发症，多于青少年期死亡，给家庭和社会带来沉重的负担。

案例-地中海贫血症 轻型地贫患者无需特殊处理，主要是针对重型地贫，需进行产前诊断。未在婚前进行有关地贫检查的夫妇，要求怀孕后早筛查，早诊断，确诊后流产是目前防止重型地贫胎儿出生、保障母体安全的唯一办法。对遗传咨询后确认为高风险地贫胎儿时，应尽早通过羊水穿刺或绒毛取样后，进行基因检测，可诊断地贫胎儿的基因型。

转基因治疗的问题与危险性 • 有效的目的基因过少； • 安全性:导入的基因缺乏调控手段； • 有效性和稳定性：缺少高效和导向的载体系统； • 目前人们多重视分子水平的研究而忽略了整体研究，对整体宏观水平缺乏了解。 1999年9月17日，美国Arizona州18岁的青年格尔辛格在宾夕法尼亚大学人类基因治疗研究所接受基因治疗4天后不幸死亡，成为基因治疗实施以来第1个直接死于这种试验的病人。

创建遗传病的动物模型 • 意义 • 研究癌症基因的致病机理；癌症基因表达的调控过程；新药物疗效； • 研究基因治疗的良好材料。 • 目前已建立了人类的动脉粥样硬化、镰刀形红细胞贫血、初期老年痴呆症、自身免疫病、淋巴组织生成、真皮炎及前列腺癌等遗传病的动物模型。

在猴子的未受精卵中加入附加基因（如老年性痴呆病的基因、帕金森病基因等），并利用它成功培育出健康活泼的小猴“安迪”。 加快针对这类疾病疫苗的开发研究。通过研究“基因敲除”的小鼠将帮助研究人类的癌症、糖尿病和高血压等慢性疾病与遗传的关系。

产前检查 • 遗传病具有垂直遗传、“终身性”、”难治性”等特征。对遗传病而言，经产前诊断终止妊娠是防止遗传病患儿出生、减少群体中致病基因频率的最为有效的手段。

产前诊断的对象 • 具有遗传病家族史，高危携带者孕妇或高危胎儿孕妇； • 夫妇之中有染色体畸变，或曾生育过病患儿的夫妇； • 35岁以上的高龄孕妇； • 夫妇之一有先天性缺陷； • 有不明原因的习惯性流产史的孕妇； • 羊水过多的孕妇； • 夫妇之一有致畸因素接触史的孕妇。

产前诊断的方法 • 非侵袭性方法包括孕妇血清与尿液检测、B超检查、X线、CT及核磁共振等。 • 侵袭性方法：不同孕周阶段采取不同的方法。羊膜腔穿刺法绒毛取样法脐穿刺法胎儿镜检法

产前诊断新进展 • 分离孕妇外周血中的胎儿细胞 • 植入前基因诊断 • 分离孕妇血浆中的胎儿DNA

DNA与证据 • 知识点： • DNA检测能鉴定人的身份 • DNA纹印已经有专门的数据库 • DNA纹印在法庭上可作为证据 • 通过DNA检测可确定其祖先（世系） • 在美国，任何人可以有权拒绝给警方提供DNA样本

DNA纹印应用到3种DNA多态性方法：微卫星、短串联重复（STRs）和单核苷酸多态性(SNPs)DNA纹印应用到3种DNA多态性方法：微卫星、短串联重复（STRs）和单核苷酸多态性(SNPs) • DNA取证常用的技术：限制性片段长度多态性（RFLP）和聚合酶链式反应（PCR） • 为以上检测提供的DNA样品来源：口腔棉球、唾液、精液和血液等 • 每个检测都可用于分析DNA，然后与其他样品进行对比分析。

案例：DNA检测威胁到受害者 • 通过PCR 等可以对犯罪现场的毛发、血样、组织等都可以进行DNA检测。 • 以前通过指认等方式判断的案件如果重新申诉，罪犯有望洗脱罪行。

DNA是如何检测的？ • DNA纹印的来源：英格兰，1975年，Dr. Alec Jeffreys比较来了自许多人的DNA纹印，他称之为DNA指纹图谱。之后运用于一个谋杀案，最后被世界各国采纳。

什么是DNA纹印？ • 最初的DNA指纹技术为多位点DNA指纹技术，又称限制性片段长度多态性技术(RFLP-第一代遗传标记)。 1980年，研究人员发现特定长度DNA序列的多态性，称之为微卫星(SSR-第二代)，其为10-100bp重复序列。短串联重复序列，比微卫星更短，在人类染色体分布广泛。随着对人类基因组认识的加深，可以检测单个基因位点【单核苷酸多态性（SNPs）-第三代】，又称DNA纹印技术。

有的人吸烟喝酒却长寿，也有人自幼就病痛缠身；同一种治疗肿瘤的药物对一些人非常有效，对另一些人则完全无效。这是为什么？有的人吸烟喝酒却长寿，也有人自幼就病痛缠身；同一种治疗肿瘤的药物对一些人非常有效，对另一些人则完全无效。这是为什么？ • 答案是他们基因组中存在的差异。这种差异很多表现为单个碱基上的变异，也就是单核苷酸的多态性（SNP）。 • SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。

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