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Western blot 实验技术

Western blot 实验技术. 定义：. 印迹法（ blotting ）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法 1975 年， Southern 建立了将 DNA 转移到硝酸纤维素膜（ NC 膜）上，并利用 DNA 或 RNA 杂交检测特定的 DNA 片段的方法，称为 Southern blotting 而后人们用类似的方法，对 RNA 和蛋白质进行印迹分析，对 RNA 的印迹分析称为 Northern blotting ，对蛋白质分子的印迹分析称为 Western blotting. Western Blot 基本原理.

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Western blot 实验技术

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  1. Western blot 实验技术

  2. 定义： • 印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法 • 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA或RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting • 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern blotting ，对蛋白质分子的印迹分析称为Western blotting

  3. Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。

  4. Western Blot一般流程 • 蛋白样品的制备 • SDS聚丙烯酰胺 凝胶电泳 • 转膜 • 封闭 • 一抗杂交 • 二抗杂交 • 底物显色

  5. SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 原理： SDS 是一种离子性的界面活性剂,它有强离子性的硫酸根离子也带有疏水性的长碳链. 当 SDS 与蛋白质混合时,它会以其碳链与蛋白质之疏水性胺基酸结合将蛋白质包起来,而以硫酸根离子外露与水分子作用. 大多数蛋白质和 SDS 的平均结合量是 1:1.4 (以重量为单位), 蛋白质与SDS结合后,由于SDS带强负价, 所以决定不同蛋白的泳动速率就只剩下分子大小一项因素

  6. 凝胶成份 • 丙烯酰胺（）和N,N’-亚甲双丙烯酰胺  • SDS • 配胶的Tris缓冲液 • TEMED • 过硫酸铵 • Tris-甘氨酸电泳缓冲液

  7. 凝胶浓度与蛋白分离范围

  8. - +

  9. 硝酸纤维素膜 膜的选择 PVDF(聚偏二聚乙烯) 转膜

  10. 转膜 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿 润滤纸之间，按0.8mA/cm2,电转1.5-2h。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装 置的缓冲液中，电转45min或过夜。

  11. 转膜后检测 • 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤 膜，换水几次。 • 预染蛋白Marker

  12. 封闭 • 脱脂奶粉（5％） • BSA • Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供）

  13. 一抗、二抗孵育 • 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积加入一抗溶液与滤膜温育。37℃一小时或4 ℃过夜。 • 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 • 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动， 37℃一小时，4 ℃过夜。 • 倒掉一抗溶液，用PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。

  14. 二抗与底物反应 辣根过氧化物酶法（HRP） 沉淀法 碱性磷酸酶法（AP） 化学发光显色法(HRP)

  15. 免疫蛋白组学流程图 等点聚焦 蛋白样品 将蛋白转移至膜上 SDS-PAGE 用抗血清杂交 考染 蛋白点匹配 质谱鉴定 后续验证

  16. SS9菌株GZ0565细胞壁蛋白二维图谱及免疫原性蛋白点SS9菌株GZ0565细胞壁蛋白二维图谱及免疫原性蛋白点 • SS9菌株GZ0565表面蛋白二维电泳图 • 当用SS9免疫血清杂交，观察到15个免疫反应性蛋白点 • (c) 当用免疫前血清杂交，没有观察到免疫反应性蛋白点

  17. Western Blot常见问题分析

  18. SDS-PAGE电泳 • 胶板洗刷干净 • 加入APS和TEMED的量要合适 • 加入试剂后摇匀，使其充分混合，防止部分胶块聚合不均匀 • 温度合适，受热不均匀导致胶聚合不均匀 • 两块玻璃板底部要对齐 • 胶不平？ • 凝胶漏液？

  19. 条带比正常的窄？ • “微笑”或“倒微笑”条带？ • 凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀，动作轻缓 • 样品盐浓度过高会挤压其他条带导致宽窄不一，纯化样品，调整盐浓度

  20. 原因 • 转膜前用100%甲醇将膜完全浸湿 • 拿取膜与吸水纸时要戴手套，更换新鲜转膜缓冲液 • 检测一抗、二抗与封闭剂是否有交叉反应 • 杂交前检测一抗、二抗的工作浓度 • 封闭不充分 • 抗体与封闭剂出现交叉反应 • 抗体浓度过高 对 策 背景太高

  21. 作业 • 1、什么是免疫转印？有什么作用？主要分成几类？ • 2、免疫转印的主要步骤有哪些？各有哪些注意点？ • 3、用示意图画出转膜过程。

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