Alek sander Grabiec 12 czerwca 2007

1. Acetylacja białek w reumatoidalnym zapaleniu stawów. Wpływ inhibitorów deacetylaz białkowych na przeżywalność komórek THP-1 i ludzkich pierwotnych makrofagów. Aleksander Grabiec 12 czerwca 2007 Promotor: dr hab. Joanna Bereta Doświadczenia przeprowadzono w laboratorium Dr Krisa Reedquista Division of Clinical Immunology and Rheumatology Academic Medical Center University of Amsterdam, The Netherlands

2. Reumatoidalne zapalenie stawów (RA) • Choroba autoimmunologiczna charakteryzująca się chronicznym stanem zapalnym stawu prowadzącym do trwałego uszkodzenia kości i chrząstki • Dotyka ok. 1% populacji • Patofizjologia związana z akumulacją aktywowanych komórek układu immunologicznego w stawie

3. Biologiczna rola acetylacji i deacetylacji Modyfikacje struktury chromatyny odgrywają kluczową rolę w regulacji ekspresji genów: • W stanie spoczynku DNA ciasno owinięte wokół oktameru histonów –zamknięta konformacja chromatyny – wyciszona ekspresja genów • Aktywacja komórki – histony ulegają acetylacji (acetylotransferazy histonów, HATs) – otwarta konformacja chromatyny – inicjacja transkrypcji genów • Usunięcie grup acetylowych przez deacetylazy histonów - kondensacja chromatyny i wyciszenie genów • Acetylacja odgrywa kluczową rolę w stymulacji ekspresji genów promujących rozwój stanu zapalnego Peter J. Barnes, 2006

4. NF-B p53 JAK/STAT FoxO Ścieżki transdukcji sygnału regulowane przez odwracalną acetylację są substratami dla: deacetylaz histonów (HDACs) sirtuin – rodzina deacetylaz zależnych od NAD Deacetylacja białek nie-histonowych Ścieżki sygnałowe, których aktywacja/modulacja jest istotna dla promocji stanu zapalnego i przeżycia komórki w RA są regulowane przez odwracalną acetylację

5. Acetylacja w stanie patologicznym – astma • Wzmożona aktywność HAT i zredukowana aktywność HDAC w drogach oddechowych pacjentów chorujących na astmę • Normalna aktywność HAT i HDAC w PBMC Zmiany aktywności HAT i HDAC pojawiają się lokalnie w drogach oddechowych prowadząc do rozwoju chronicznego stanu zapalnego Peter J. Barnes, 2004

6. Deacetylazy histonów jako nowy cel terapeutyczny w leczeniu RA? Analiza wpływu inhibitorów deacetylaz histonów na komórki istotne w patofizjologii RA oraz na zwierzęce modele RA: In vitro: • Uczulają synowiocyty (FLS) na apoptozę indukowaną przez TRAIL (Jungel et al., Annals of the Rheumatic diseases, 2006) • Blokują produkcję metaloproteinaz macierzy zewnątrzkomórkowej (MMPs) przez ludzkie chondrocyty (Young et al., Arthritis Research and Therapy, 2005) In vivo: • Hamują zapalenie stawów indukowane adjuwantem u szczurów (Chung et al., Molecular therapy, 2003) • Hamują zapalenie stawów indukowane autoprzeciwciałami u myszy (Nishida et al., Arthritis and Rheumatism, 2004)

7. Cele badawcze • Jaki jest poziom acetylacji białek w błonie maziowej pacjentów z RA? • Czy występują różnice w poziomie acetylacji pomiędzy różnymi komórkami w obrębie błony maziowej? • Czy te różnicę są związane z konkretnymi typami komórek? • Czy inhibitory deacetylaz białkowych mogą wywoływać apoptozę w komórkach istotnych w patofizjologii RA? • W jaki sposób zahamowanie aktywności deacetylaz wpływa na produkcję cytokin prozapalnych?

8. kontrola acetylowana lizyna CD3 Pacjent 1 Pacjent 2 Hiperacetylacja białek jądrowych w błonie maziowej pacjentów z RA

9. CD3 CD22 CD55 CD68 CD163 kontrola makrofagi Czy różnice w stopniu acetylacji białek jądrowych są związane z konkretnym typem komórek? Podwójne barwienie immunofluorescencyjne błony maziowej pacjentów z RA: • Zielone barwienie – acetylowana lizyna • Czerwone barwienie – markery powierzchniowe komórek: • CD3 – limfocyty T • CD22 – limfocyty B • CD55 – FLS • CD68 • CD163

10. 60 50 40 % komórek wykazujących hiperacetylację 30 20 10 0 CD3 CD22 CD55 CD68 CD163 Analiza ilościowa podwójnego barwienia immunofluorescencyjnego • Podwójne barwienie wycinków tkanek pochodzących od 4 pacjentów z RA • Analiza ilości jąder komórkowych wykazujących hiperacetylację przypadających na 100 komórek każdego typu Hiperacetylacja białek występuje głównie w makrofagach i synowiocytach błony maziowej

11. trichostatyna A Czy zahamowanie aktywności deacetylazowej wpływa na przeżywalność komórek in vitro? Komórki: • THP-1 – ludzka białaczkowa linia monocytarna • Ludzkie pierwotne makrofagi 24-godzinna inkubacja z inhibitorami deacetylaz: • trichostatyna A – antybiotyk przeciwgrzybiczy wykazujący aktywność cytostatyczną, specyficzny inhibitor aktywności HDAC • nikotynoamid – inhibitor sirtuin Pomiar apoptozy – barwienie aneksyną V sprzęgniętą z FITC, kontrbarwienie jodkiem propydyny  analiza cytometryczna nikotynoamid

12. makrofagi THP-1 35 35 30 30 25 25 20 20 % kom. apoptotycznych % kom. apoptotycznych 15 15 10 10 5 5 0 0 0,1 10 20 10 20 2,0 5,0 1,0 1,0 2,0 5,0 0,5 0,25 0,25 medium medium TSA [μM] Nic [mM] TSA [μM] Nic [mM] Czy zahamowanie aktywności deacetylazowej wpływa na przeżywalność komórek in vitro? TSA i nikotynoamid indukują apoptozę w komórkach THP-1 i ludzkich makrofagach

13. THP-1 makrofagi 30 45 medium medium 40 TNF 10 ng/ml TNF 10 ng/ml 25 35 20 30 25 % kom. apoptotycznych % kom. apoptotycznych 15 20 10 15 10 5 5 0 0 med 0,1 0,25 0,5 med 1,0 2,0 TSA [M] TSA [M] Jak zahamowanie aktywności deacetylazowej wpływa na pro-apoptotyczne właściwości TNFα? Koinkubacja z TNFα: • uczula ludzkie makrofagi na apoptozę indukowaną inhibitorami deacetylaz • zwiększa pro-apoptotyczne właściwości inhibitorów deacetylaz w komórkach THP-1

14. Jaki jest molekularny mechanizm apoptozy indukowanej przez inhibitory deacetylacji białek? Hipoteza: Trichostatyna A i nikotynoamid modulują profil ekspresji genów pro- i anty-apoptotycznych Metoda: MLPA – multiplex ligation-dependent probe amplification: • Umożliwia oszacowanie ilości kopii 40 różnych sekwencji DNA • Amplifikacja genów bezpośrednio zaangażowanych w regulację apoptozy • Ilość każdego produktu amplifikacji odzwierciedla względną ilość kopii analizowanej sekwencji docelowej

15. mRNA gene B gene A Odwrotna transkrypcja cDNA Struktura sondy: gene B gene A Hybrydyzacja sondy hemi-probe A’ hemi-probe A PCR primer sequence Y Para pół-sond hybrydyzuje z przylegającymi sekwencjami docelowymi PCR primer sequence X stuffer sequence A A A’ hybridization sequences gene B gene A hemi-probe B’ ligacja PCR primer sequence Y hemi-probe B PCR primer sequence X primer X primer Y stuffer sequence B primer X primer Y B B’ ligation product B hybridization sequences ligation product A Reakcja PCR wykorzystująca jedną parę starterów dla wszystkich produktów ligacji Product A Produkt amplifikacji ma unikalną długość dla każdego genu, ilość produktu reprezentuje względną ekspresję analizowanego genu Product B Zasada działania testu MLPA

16. A1/Bfl-1 0.8 0.6 relative expression 0.4 Bcl-2 Bmf 0.2 MAP-1 3.0 2.5 1.25 0.0 2.5 2.0 medium TSA Nic 1.00 2.0 1.5 0.75 relative expression relative expression 1.5 relative expression 1.0 0.50 1.0 0.5 0.5 0.25 0.0 0.0 0.00 medium medium TSA TSA Nic Nic medium TSA Nic TSA i nikotynoamid regulują ekspresję genów pro- i anty-apoptotycznych w komórkach THP-1 Geny anty-apoptotyczne: Geny pro-apoptotyczne:

17. Nic 20 mM TSA 1 μM medium A1 Bmf Actin Potwierdzenie zmiany profilu ekspresji genów na poziomie białka W komórkach THP-1: • Nikotynamid powoduje obniżenie ekspresji anty-apoptotycznego białka A1 (białko z rodziny Bcl-2, stabilizujące potencjał błony mitochondrialnej) • Zarówno TSA jak i, w mniejszym stopniu, nikotynamid indukują ekspresję pro-apoptotycznego białka Bmf (białko z rodziny BH3-only, indukuje apoptozę przez inaktywację Bcl-2)

18. B A TSA 2 μM Nic 20mM medium medium 24 h 24 h 240’ 240’ 30’ 120’ 30’ 120’ 60’ 60’ 37,8 37,8 30,9 30,9 17,2 17,2 Jaki jest molekularny mechanizm apoptozy indukowanej przez inhibitory deacetylacji białek? Hipoteza: TSA i nikotynoamid regulują ekspresję genów pro- i antyapoptotycznych poprzez indukcję hiperacetylacji białek niehistonowych Metoda: • Liza makrofagów stymulowanych TSA i nikotynoamidem • Analiza western blotting – przeciwciała przeciwko acetylowanej lizynie

19. 25 2.5 med med TNF 10 ng/ml TNF 10 ng/ml 20 2.0 15 1.5 stężenie TNFα [ng/ml] stężenie IL-6 [ng/ml] 10 1.0 5 0.5 0 0.0 med 1,0 2,0 10 20 med 1,0 2,0 10 20 TSA [μM] TSA [μM] Nic [mM] Nic [mM] Analiza wpływu inhibitorów deacetylaz na profil ekspresji cytokin prozapalnych Zahamowanie aktywności deacetylazowej nie wpływa na produkcję IL-6 i TNFα przez niestymulowane makrofagi Inhibitory deacetylaz hamują indukowaną TNFα produkcję IL-6 i TNFα przez makrofagi

20. Wnioski • Białka jądrowe ulegają hiperacetylacji w błonie maziowej pacjentów z RA, przy czym wysoki poziom acetylacji charakteryzuje przede wszystkim makrofagi i synowiocyty • Inhibitory deacetylacji indukują apoptozę w komórkach THP-1 i ludzkich makrofagach oraz uczulają komórki na apoptozę indukowaną TNFα • Apoptozie indukowanej przez inhibitory deacetylaz nie towarzyszy stymulacja produkcji cytokin prozapalnych – TSA i nikotynoamid obniżają produkcję IL-6 i TNF przez aktywowane makrofagi Inhibitory deacytelaz białkowych ze względu na swoje pro-apoptotyczne i przeciwzapalne właściwości mogą wykazywać wysoki potencjał terapeutyczny w leczeniu reumatoidalnego zapalenia stawów