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STRUCTURE DE LA MEMBRANE. II - LES PROTÉINES MEMBRANAIRES. Porteuses de la plupart des fonctions des membranes Variable en fonction du type de cellule myéline : protéines  25 % de la masse membrane interne des mitochondries : protéines  75 % de la masse

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Presentation Transcript
ii les prot ines membranaires
II - LES PROTÉINES MEMBRANAIRES
  • Porteuses de la plupart des fonctions des membranes
  • Variable en fonction du type de cellule
    • myéline : protéines  25 % de la masse
    • membrane interne des mitochondries : protéines  75 % de la masse
    • en général : protéines  50 % de la masse
  • 50 molécules de lipide pour une molécule de protéine
  • Souvent glycosylées
fig 10 17 1 4

Modes d'insertion des protéines dans la double couche lipidique (1/2)

Fig 10-17 (1à4)

Simple hélice 

Cylindre 

Multiple hélice 

fig 10 17 5 8

Modes d'insertion des protéines dans la double couche lipidique (2/2)

Fig 10-17 ( 5 à 8)

 Phosphatidyl inositol

Au départ protéine transmembranaire à un passage dans le RE

 Chaine d'acide gras ou groupe prényl.

Au départ protéine cytosolique soluble

prot ines li es aux lipides exemple 5
Protéines liées aux lipides Exemple 5
  • Synthèse de la protéine dans le cytosol comme une protéine soluble
  • Fixation d'un lipide par liaison covalente
  • Transport vers la membrane
fig 10 18
Fig 10-18

Exemple 5 : attachement d'une protéine membranaire par une chaîne d'acide gras ou un groupement prényl

slide8
Exemple 5 : attachement d'une protéine membranaire par une chaîne d'acide gras ou un groupement prényl
  • Aide à localiser une protéine soluble dans la membrane
  • Peut être transitoire
exemple 6 prot ines li es aux lipides
Exemple 6 : protéines liées aux lipides
  • Synthèse de la protéine dans le RE comme une protéine transmembranaire à un passage
  • Dans le RE le segment transmembranaire de la protéine est clivé
  • Un GlycosylPhosphatidylnositol (GPI) est ajouté
  • La protéine se retrouve liée à la face non cytosolique de la membrane
  • Facile à reconnaître grâce à une phospholipase C spécifique du phosphatidylInositol
exemples 7 et 8 prot ines p riph riques
Exemples 7 et 8 : protéines périphériques
  • Liaisons non covalentes avec d'autres protéines de la membrane
  • Peuvent être libérées par les procédés d'extraction doux (force ionique ou pH)
prot ines int grales
Protéines intégrales
  • = protéines intrinsèques
  • Nécessitent des procédés énergiques pour être libérées
prot ines membranaires
Protéines membranaires
  • Transmembranaires
    • agissent des deux côtés de la membrane
    • transport de molécules
    • comprennent les récepteurs
      • reconnaissance extra cellulaire
      • message intra cellulaire
  • Non transmembranaires
    • associées aux lipides et/ou protéines d'une seule face de la membrane
    • eg : médiation chimique intra cellulaire (moitié cytosolique de la membrane)
prot ines transmembranaires
Protéines transmembranaires
  • Toujours orientation unique dans la membrane
  • Dû à la synthèse dans le réticulum endoplasmique
  • Presque toujours en hélice 
  • Ou cylindre 
fig 10 20 ab
Fig 10-20 (AB)

Prédiction de la localisation d'hélice  d'une protéine par profil d'hydrophobicité

fig 10 20 c
Fig 10-20 C

Proportion prévisible de protéines membranaires dans le génome

cylindres
Cylindres 
  • Forment une structure rigide
  • facile à cristalliser ( hélice )
  • Le nombre de plis  peut varier de 8 à 22
fig 10 21 1de2
Fig 10-21 (1de2)
  • Cylindres 

E. coli

E. coli

Récepteur à un virus bactérien

Lipase

fig 10 21 2de2

L'intérieur est comblé par un domaine globulaire de protéine qui contient un site de fixation du fer

Fig 10-21(2de2)
  • Cylindres 

Rhodobacter capsulatus

E. coli

Transporteur d'ions

les cylindres
Les Cylindres 
  • Abondants dans la membrane externe des mitochondries
  • Forment des pores (eg : porine)
  • Souvent boucles qui font saillie dans la lumière
  • Parfois porines spécifiques (maltoporines)
  • Surtout membranes externes des bactéries, mitochondries, chloroplastes
  • Beaucoup plus rares que hélices  chez les eucaryotes
  • Plus rigides que l'hélice 
forrest lr2000 fig1 review membrane simulations bigger and better
Forrest,LR2000(Fig1) Review Membrane simulations: bigger and better?

Simulations d'une hélice de protéine transmembranaire dans une bicouche lipidique. Simulations de (a) 18-mer, (b) 26-mer and (c) 34-mer modèles de l'hélice  de la protéine transmembranaire M2 du virus influenza A dans une bicouche lipidique

forrest lr2000 fig2 review membrane simulations bigger and better
Forrest,LR2000(Fig2) Review Membrane simulations: bigger and better?

Simulations de canaux ioniques dans une bicouche lipidique. (a) Hélice M25 (b) Canal potassique KcsA

fig 10 22
Fig 10-22
  • Protéine transmembranaire à un passage glycosylée
  • Glycosylation dans le RE et Golgi 
  • La face glycosylée est la face non cytosolique
  • Ponts S—S sur la face non cytosolique
c d tergents
C - Détergents
  • Petites molécules amphiphiles
  • Permettent de solubiliser les protéines transmembranaires
    • Extrémité polaire chargée (ionique) : sodium dodécyl sulfate (SDS)
    • Extrémité polaire non chargée (non ionique) : triton
fig 10 23
Fig 10-23
  • Micelle de détergent dans l'eau
fig 10 24
Fig 10-24
  • Solubilisation de protéines membranaires par un détergent léger: il y a solubilisation des protéines membranaires et des phospholipides de la membrane
fig 10 25
Fig 10-25
  • SDS : détergent anionique
  • Triton X-100 : détergent ionique
  • Portion hydrophobe du détergent en vert
  • Portion hydrophile du détergent en bleu
sds page
SDS - Page
  • Solubilisation des protéines par SDS : solubilisation de la protéine avec dénaturation (déroulement)
  • Parfois réversible
  • Electrophorèse en Gel de PolyAcrylamide (PAGE)
  • A révolutionné l'étude des protéines membranaires
fig 10 26
Fig 10-26
  • Utilisation de détergents légers pour solubiliser, purifier et reconstituer des systèmes de protéines fonctionnels
  • Très bel exemple
d les globules rouges
D - Les globules rouges
  • = Hématies = érythrocytes
  • Facilement disponibles
  • Faciles à isoler
  • Pas de noyau, pas d'organite interne
  • Une seule membrane = membrane plasmique
  • Création de fantômes membranaires
fig 10 27
Fig 10-27

Globules rouges en microscopie électronique à balayage

fig 10 28
Fig 10-28
  • Préparations de fantômes de globules rouges
    • refermés ou non
    • retournés ou non
m thodes
Méthodes
  • Marquage "vectoriel" : marqueur radioactif ou fluorescent soluble (ne se fixe que sur la face exposée)
  • Enzymes protéolytiques
  • Anticorps marqués
  • SDS-PAGE
r sultats
Résultats
  • Certaines protéines traversent la bicouche lipidique
  • La composition des deux feuillets lipidiques est différente
fig 10 29
Fig 10-29
  • SDS-PAGE des protéines de la membrane du globule rouge humain  environ 15 protéines majeures (15000 à 250000 D)
  • Spectrine + glycophorine + bande 3 > 60 % en masse des protéines membr anaires
a spectrine
a- Spectrine
  • Protéine du cytosquelette associée à la face cytosolique de la membrane du globule rouge
  • Principal constituant du cytosquelette qui donne sa forme biconcave au GR
  • Permet au GR de se déformer pour passer dans les petits capillaires
  • Mutations dans le gène de la spectrine  anémie avec GR sphériques (=sphérocytose héréditaire = Minkowski-Chauffard)
  • 25 % en masse des protéines associées à la membrane
  • Longueur = 100 nm (250 000 copies / cellule)
fig 10 30 a
Fig 10-30 A
  • Molécules de spectrine du GR humain
    • Hétérodimère qui forme des tétramères
    • deux chaînes polypeptidiques  et  anti parallèles enroulées
    • extrémité phosphorylée pour former le tétramère
fig 10 30 b
Fig 10-30 B

Molécules de spectrine du GR humain en microscopie électronique

fig 10 31 a

100 nm

Fig 10-31 A
  • Hétérodimère qui forme des tétramères (200 nm de long)
  • 4 ou 5 tétramères sont liés dans des complexes de jonction qui contiennentactine(13 monomères)bande 4.1, adducineettropomyosine
liaison de spectrine la membrane
Liaison de spectrine à la membrane
  • Ankyrine
    • Liaison de la spectrine à la membrane
    • Se lie à
      • spectrine
      • bande 3 (protéine transmembranaire)
    • Limite la diffusion latérale de bande 3
  • Bande 4.1
    • Liaison de la spectrine à la membrane
    • Se lie à
      • spectrine et ankyrine
      • bande 3 et glycophorine
fig 10 31b
Fig 10-31B
  • Spectrine du cytosquelette de la face cytosolique du GR humain en microscopie électronique (coloration négative)
autres cellules que le gr
Autres cellules que le GR
  • Beaucoup plus compliqué
  • Cortex du cytosol riche en actine
  • Cf. chapitre cytosquelette
b glycophorine

b - Glycophorine

Une des premières protéines membranaires à être séquencée

1 million de molécules par cellule

131 acides aminés

Fonction inconnue

N'existe que dans le GR

Type de la molécule transmembranaire à un passage

glycophorine
Glycophorine
  • En général homodimère
  • Extrémité -N à l'extérieur
  • 100 résidus glucose (90 % des sucres de la membrane du GR)
  • Un passage : hélice  hydrophobe de 23 acides aminés
fig 10 32
Fig 10-32
  • Transformation d'une chaîne protéique à plusieurs passages en deux chaînes protéiques à plusieurs passages
  • A et B = même résultat
    • A : un gène
    • B : deux gènes
c bande 3
c - Bande 3
  • Protéine transmembranaire de 930 acides aminés
  • 12 passages
  • Transport du CO2 des tissus vers les poumons
  • Transporteur d'anions qui permet à HCO3- de traverser la membrane
  • Se voit en cryofracture
photo de branton
Photo de Branton

Daniel Branton (1932 - )

fig 10 33
Fig 10-33
  • Congélation dans l'azote liquide
  • Fracture du bloc de glace avec un couteau
  • Le plan de fracture passe entre les deux feuillets hydrophobes de la membrane
  • Les plans de fracture sont ombrés au platine
  • Examen de la réplique au microscope électronique à transmission
cryofracture
Cryofracture
  • Face P(rotoplasmique) face E(xterne)
fig 10 34
Fig 10-34
  • Globule rouge humain en cryofracture
  • Surtout bande 3
fig 10 35
Fig 10-35
  • Devenir probable des molécules de glycophorine et bande 3 du GR humain pendant la cryofracture

La protéine tend à rester avec le feuillet qui contient la plus grosse partie de la protéine

e bact riorhodopsine
E - Bactériorhodopsine
  • Protéine de transport de la membrane plasmique dont on connaît bien la structure 3D dans la bicouche lipidique
  • Pompe à protons activée par la lumière de la membrane plasmique de certains archaea
  • Structure semblable à de nombreuses autres protéines de membrane
fig 10 36
Fig 10-36
  • Halobacterium salinarum
    • Archeae
    • Vivent en eau salée et au soleil
    • Possèdent des "patch" dans leur membrane plasmique appelée "membrane pourpre"
    • Chaque patch ne contient qu'une sorte de protéine : la bactériorhodopsine
halobacterium salinarum cells as seen with a dark field optical microscope
Halobacterium Salinarum cells, as seen with a dark-field optical microscope

www.ib.pi.cnr.it/groups/ halob/flabat.html

slide58

Halobacterium salinariumis an extreme halophile that grows at 4 to 5 M NaCl and does not grow below 3 M NaCl. This freeze etched preparation shows the surface structure of the cell membrane and reveals smooth patches of "purple membrane" (bacteriorhodopsin) embedded in the plasma membrane.

  • http://images.google.fr/imgres?imgurl=soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbes/halobacterium2.gif&imgrefurl=http://soils1.cses.vt.edu/ch/biol_4684/Microbes/halo.html&h=300&w=244&prev=/images%3Fq%3Dhalobacterium%2Bsalinarum%26svnum%3D10%26hl%3Dfr%26lr%3D%26ie%3DUTF-8%26sa%3DN
lyophilized purple membranes
Lyophilized purple membranes
  • Extremely halophilic microrganisms of the Archaea domain produce a purple membrane, the chromophore consisting of a retinal-protein complex called bacteriorhodopsin
slide60

Top view of the purple membrane patch. The hexagonal unit cell is displayed in the middle of the patch, surrounded by white line defining the unit-cell dimensions.

krebs mp2000p15 fig2
Krebs,MP2000p15 (fig2)
  • (A) Vue latérale d’un monomère de bactériorhodopsine comme on le voit dans le trimère
  • (B) Vue cytoplasmique de la membrane pourpre
bacteriorhodopsin contient un groupe absorbant la lumi re ou chromophore le r tinal
Bacteriorhodopsin : contient un groupe absorbant la lumière ou chromophore (le rétinal)

http://www.biologia.uniba.it/fisiologia/corcelli/en/br.htm

r tinal
Rétinal
  • = vitamine A dans sa forme aldéhyde
  • Le même chromophore que dans la rhodopsine de la rétine
  • Lié de façon covalente à une lysine de la protéine
fontionnement de la rhodopsine
Fontionnement de la rhodopsine
  • Un photon  le chromophore change de forme  modification de la conformation de la protéine 
  • Transfert d'un ion H+ du cytosol vers l'extérieur de la cellule
fig 10 37
Fig 10-37
  • Bactériorhodopsine

7 hélices  de 25 acides aminés chacune

fontionnement de la rhodopsine1
Fontionnement de la rhodopsine
  • Le transfert du proton entraîne un gradient
  • qui entraîne la formation d'ATP
  • grâce à une seconde protéine 
  • Sorte de pile solaire
bact riorhodopsine
Bactériorhodopsine
  • Modèle pour beaucoup d'autres protéines à 7 passages
    • Bactériorhodopsine (transporteur)
    • Transmetteurs de signaux
fig 10 38
Fig 10-38
  • Autre exemple (que bactériorhodopsine)
  • Structure 3D du centre de photosynthèse de Rhodopseudomonas viridis
    • 4 sous-unité : L,M,H, cytochrome
  • Première protéine transmembranaire à être cristallisée et analysée
f diffusion lat rale des prot ines
F - Diffusion latérale des protéines
  • Flip flop : non
  • Diffusion rotatoire : oui
  • Diffusion latérale : oui
    • Hétérocaryons
    • FRAP
    • FLIP
fig 10 39
Fig 10-39
  • Hétérocaryon Homme/Souris de L.D. Frye & M. Edidin (1970)
fig 10 40 frap
Fig 10-40 FRAP
  • Fluorescence recovery After Photobleaching
fig 10 40 flip
Fig 10-40 FLIP
  • Fluorescence Loss In Photobleaching
domaines membranaires
Domaines membranaires
  • Membrane = mer de lipides + protéines qui flottent dedans  simpliste
  • Confinement de protéines dans des domaines spécifiques de la cellule
    • Cellule épithéliale (intestin ou rein)
    • Distribution asymétrique des protéines
    • Distribution asymétrique des lipides
    • Pas d'échange de lipides ou protéines entre les domaines des feuillets externes
  • Rôle des tight junctions (jonctions étanches = jonctions serrées)
fig 10 41
Fig 10-41
  • Limitation de la mobilité d'une protéine membranaire dans un domaine : cellule épithéliale
application au spermatozo de
Application au spermatozoïde
  • Création domaines membranaires sans jonctions intercellulaires
  • Trois domaines distincts (au moins)
    • région acrosomique
    • région post acrosomique
    • queue
  • Barrière inconnue
fig 10 42
Fig 10-42
  • Spermatozoïde de cobaye
  • Anticorps spécifique de chaque région
autres exemples
Autres exemples
  • Cellule nerveuse
    • Axone
    • Dendrite
  • Beaucoup d'autres
m canismes d immobilisation des prot ines
Mécanismes d'immobilisation des protéines
  • Halobacterium : "membrane pourpre" : cristal qui immobilise et limite la diffusion
  • Assemblages macromoléculaires à l'intérieur ou à l'extérieur de la membrane
    • eg : GR cf.supra
fig 10 43
Fig 10-43
  • Quatre mécanismes de restriction de la mobilité latérale de protéines spécifiques de la membrane plasmique
    • (A) - auto-assemblage en gros agrégats (eg : "membrane pourpre")
    • (B) - assemblage à l'extérieur de la cellule
    • (C) - assemblage à l'intérieur de la cellule
    • (D) - entre deux cellules