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ATP 检测技术基础理论及在 医院感染控制中的应用. 中国疾病预防控制中心 邱 侠 2011.12.22. 目录. ATP 检测技术的理论基础 ATP 检测技术在医疗机构中的应用研究 ATP 检测技术在医院感染控制中的应用 如何进行仪器及试剂的选择. ATP 检测技术的理论基础( 1 ). ATP 主要存在于细胞内 ATP (三磷酸腺苷)存在于动物细胞、微生物细胞、植物细胞中, 同类活细胞内的含量基本一致; 动物细胞中 ATP 含量: 1.000-100.000 amol ATP 细菌细胞中 ATP 含量: 0.5-2 amol ATP ;
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ATP检测技术基础理论及在医院感染控制中的应用ATP检测技术基础理论及在医院感染控制中的应用 中国疾病预防控制中心 邱 侠 2011.12.22.
目录 • ATP检测技术的理论基础 • ATP检测技术在医疗机构中的应用研究 • ATP检测技术在医院感染控制中的应用 • 如何进行仪器及试剂的选择
ATP检测技术的理论基础(1) ATP主要存在于细胞内 • ATP(三磷酸腺苷)存在于动物细胞、微生物细胞、植物细胞中,同类活细胞内的含量基本一致; • 动物细胞中ATP含量:1.000-100.000 amol ATP • 细菌细胞中ATP含量:0.5-2 amol ATP; • 在自然界中,绝大部分细菌的ATP含量在2amol ATP,大多数体细胞ATP含量大约为1000amol ATP,因此以上述含量值分别作为细菌和体细胞的代表值; • 细胞在自然凋亡的情况下,ATP含量会有变化。
ATP(三磷酸腺苷) ADP(二磷酸腺苷) AMP(一磷酸腺苷) ATP检测技术的理论基础(2) ATP, ADP and AMP 在活的和死亡细胞内的情况 Energy • 活细胞 • 酶融后的细胞 • C. 细胞自然凋亡或受到其它介质影响后ATP的情况
ATP检测技术的理论基础(3) 技术原理 • 沾染在物体表面、医疗器械上的血液、组织液等体液中含有大量的体细胞和细菌等污染物,这些生物污染可以通过ATP生物荧光法测出。 • 萤光素酶在Mg2+、ATP、O2的参与下进行酶促反应放出光子 • 仪器定量测定发光值RLU或使用ATP标准品测得含量,从而获知污染物污染水平,来判断物表、器械的污染程度和清洗效果。 • 通过使用体细胞ATP消除技术,可对残留细菌进行检测。 • 现有技术可以检测到1 amolATP
ATP的应用 • 洁净度检测(ATP总量检测) 细胞外ATP+体细胞ATP +微生物细胞ATP 可用于卫生监测、微生物生长控制等 • 细菌细胞计数 利用体细胞裂解剂+ATP水解酶去除细胞外和体细胞ATP 可用于细菌总数检测、药敏试验、疾病诊断(如菌尿检测)等 • 体细胞计数 ATP水解酶去除细胞外ATP 可用于体细胞计数、药敏试验等
ATP检测技术在医疗机构应用研究 研究背景 2005年卫生部消毒标准委员会、中国疾病预防控制中心消毒检测中心联合北京创新世纪生化科技发展有限公司、瑞典BioThema公司和美国Hygiena国际公司在国内率先开展了ATP检测技术的基础理论、医疗器械清洗效果、医用清洗剂质量评价、临床应用等方面的研究。 本研究成果在《医用清洗剂卫生标准》、《医院消毒卫生标准》国标制定中用于评价医用清洗剂质量和医疗器械洁净度筛查,并发表了多篇论文、论著。
国外技术支持 • BioThema公司: • 其创始人Dr. Lundin从事ATP研究近40年,担任生物发光和化学发光国际协会理事和生物发光和化学发光科学杂志的欧洲编委,并发表了60多篇ATP方面的各类论文及专著,在该领域享有极高的声望; • 其公司的ATP标准品通过了瑞典标准机构的认证作为标准物质; • 目前正在协助中国CDC制定基于ATP含量检测的国家标准; • Hygiena公司: • 是世界最大的ATP检测专业公司之一; • 公司通过美国FDA认证; • 其英国分公司配合英国卫生部开展了大量医疗应用的研究。
研究报告 研究报告分为三部分: 1)ATP生物荧光法评价医疗器械清洗效果的研究; 2)目测、放大镜下观察、潜血试验和ATP生物荧光法对清洗后的医疗器械清洗效果评价结果的比较; 3)临床研究及验证
第一部分 ATP生物荧光法评价医疗器械清洗效果的研究
试验一ATP生物荧光法与细菌计数法的相关性研究试验一ATP生物荧光法与细菌计数法的相关性研究 图1试验一方法流程图 1. 金黄色葡萄球菌(ATCC6538)测定结果: 取37℃培养18~24hATCC6538,以TSB洗菌,制成菌悬液,梯度稀释 表中cfu和RLU值均为5次试验结果平均值。 图2金黄色葡萄球菌菌落数对数值与RLU对数值的线性关系
大肠杆菌(8099) 图3 试验一方法流程图 2. 大肠杆菌(8099)测定结果: 取37℃培养18~24h8099, 以TSB洗菌,制成菌悬液梯度稀释 表中cfu和RLU值均为5次试验结果平均值。 图4大肠杆菌菌落数对数值与RLU对数值的线性关系
试验二ATP生物荧光法测定血液残留量 1. 对不同稀释度血液的RLU观察: 图5 试验二方法流程图 图6 血液稀释倍数对数值与RLU对数值的线性关系
试验三ATP生物荧光法测定超声波清洗器清洗前后血液残留量试验三ATP生物荧光法测定超声波清洗器清洗前后血液残留量 不同血液浓度、不同清洗条件,ATP生物荧光法测定结果: A. 清洗液清洗5min+水洗1min B. 水洗6min C. 清洗液清洗2min+水洗1min D. 水洗3min 取50 μL血液 滴染于齿部 图7 试验三方法流程图 阴性对照为16、18、19和15。
试验四 细菌计数、ATP生物荧光法测定超声波清洗器清洗前后细菌残留 1. 在超声波清洗器中,水洗与清洗液清洗后,细菌计数法和ATP生物荧光法测定结果: 取10 μL金葡 菌液滴染齿部 置5mLTPS管中 A. 清洗液清洗2min+水洗1min B. 水洗3min C. 清洗液清洗5min+水洗1min D. 水洗6min 图8 试验四方法流程图 阴性对照:细菌计数为0 cfu,ATP生物荧光法测定RLU为14。.
2. 根据金黄色葡萄球菌菌落数对数值与RLU对数值的线性关系y=1.3199x — 0.8317,计算出不同清洗条件下残留菌数的RLU理论值。理论值与实际值相比见下表:
第一部分 小 结 • 1.金黄色葡萄球菌和大肠杆菌分属革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌,在室温下分别对两种细菌不同稀释度菌液的RLU进行测定,结果显示,在102~108cfu范围内,菌落数对数值与RLU对数值之间呈线性关系(R2>0.99,P<0.01),说明两种细菌均可以通过测定RLU确定细菌数量。 • 2.对室温下不同稀释度的血液进行了测定,分析结果显示,血液稀释到10-2~10-9时,随着血液稀释度的增加,RLU逐渐降低,对采自同一个人的血液,血液稀释倍数的对数值与RLU对数值之间成线性关系(R2=0.9803),说明测定RLU可以确定血液含量,最低可以测到稀释10-9的血液。
3. BT-112D检测系统,测定超声波清洗器清洗前、后血液残留: • 3.1 相同浓度污染物污染医疗器械,相同清洗时间,清洗液清洗组RLU显著低于水洗组RLU,二者之间有显著性差异(P<0.05),这与清洗液松解有机物,使其从器械表面脱落有关。 • 3.2 相同浓度污染物污染医疗器械,清洗时间越长,RLU之越低。
4. 细菌计数、BT-112D检测系统,测定超声波清洗器清洗前、后细菌残留: • 4.1 通过细菌计数和ATP生物荧光测定结果可以发现,在超声波清洗器中清洗液清洗2min+水洗1min和单纯水洗3min相比,清洗液有利于去除细菌,清洗液清洗组和水洗组之间的细菌数和RLU皆有显著性差异。 • 4.2 通过超声波清洗器清洗前后,细菌计数结果与标定菌量和RLU通过拟合公式计算的理论值及实测值相吻合。
第二部分 目测、放大镜下观察、潜血试验、BT-112D检测系统测定直接清洗液清洗与预洗后清洗液清洗血液残留
试验一 潜血试验和ATP生物荧光的灵敏度比较 1、潜血试验和ATP生物荧光法测定血液残留结果: 取50 μL血液 滴染于齿部 分子代表阳性样本数,分母代表检测样本数;阴性对照不变色。 ATP生物荧光法测定阴性对照RLU为16、18、17、19和15。. 图9 试验一方法流程图
试验二放大镜、潜血试验和ATP生物荧光的灵敏度比较试验二放大镜、潜血试验和ATP生物荧光的灵敏度比较 流动水 冲洗刷洗1.5min A.清洗液浸泡5min B.清洗液浸泡2min 流动水预洗30s 取50 μL血液 滴染于齿部 图10试验二方法流程图
试验结果 1. 预洗组 1.1 预洗后清洗液浸泡2min组,潜血试验检测结果: 1.2 预洗后清洗液浸泡5min组,潜血试验检测结果: -代表阴性,+代表阳性,潜血试验阳性对照为蓝色,阴性对照不变色 -代表阴性,+代表阳性,潜血试验阳性对照为蓝色,阴性对照不变色 2. 直接清洗液浸泡组 2.2 清洗液浸泡2min组、5min组,潜血试验检测结果:
3. ATP生物荧光法测定结果 3.1 预洗后清洗液浸泡2min组,放大镜下观察与ATP生物荧光测定结果: 3.2 预洗后清洗液浸泡5min组,放大镜下观察与ATP生物荧光测定结果: 阳性对照RLU为4846479、5426617、5329203、5115037、4838111; 阴性对照RLU为15、16、18、19、18. 阳性对照RLU为4846479、5426617、5329203、5115037、4838111; 阴性对照RLU为15、16、18、19、18.
第二部分 小 结 • 1. 污染有10-6血液稀释液的医疗器械,潜血试验结果皆为阴性,测不出血液残留,而ATP生物荧光法仍可定量测出,说明BT-112D检测系统,检测血液残留时比潜血试验更为灵敏。 • 2. 预洗后清洗液浸泡组、直接清洗液浸泡组,共清洗样本120件。肉眼观察全为阴性,但放大镜下观察,阳性数为35件,这可能因为止血钳齿部凹凸不平,且难以观察到粒径<50 μm污物有关。 • 3. 本试验中,对肉眼观察皆为阴性的80件样本进行潜血试验,结果显示,潜血试验阳性的样本为66件,阳性率为82.5%。说明,检测血液残留时,潜血试验优于目测法。
4. 在预洗后清洗液浸泡5min组的40件样本中,随机抽取20件进行潜血试验,阴性样本数为14件;另外20件样本进行BT-112D检测系统,测得RLU值为877~4874。说明,潜血试验测定为阴性的样本,ATP生物荧光法仍可能测出血液残留。 • 5. 试验中发现,放大镜下观察为阳性,其潜血试验不一定为阳性;某些放大镜为阳性的样本,其RLU值却未必高。这可能因为清洗后的器械,仍有非有机物残留,如锈迹,因此在器械清洗后,除锈亦非常重要。 • 6. 综上,测定血液残留灵敏性排序为:ATP生物荧光法>潜血试验> 放大镜下观察> 目测。
RLU≤2000作为评价器械清洗效果参考值的依据 • 研究表明清洗剂中含有的表面活性剂可破坏体细胞,使胞内ATP下降并释放出来; • 在ISO /TS15883 - 5的B.6.8 中提到,每个测试块(片)上细菌数> 1.0 ×107 cfu,要求清洗后细菌的最小减少系数(RF)为4。即医疗器械清洗后,其细菌残留< 1.0 ×103cfu,此时通过拟合公式(y=1.3199x — 0.8317)计算对应的RLU为800-1000,洁净度检测采集到的样本为总ATP(胞外ATP和细胞内ATP)应考虑到细菌细胞外的ATP残留; • 结合国外相关研究及在国内的基础研究、临床验证,给出BT-112D荧光仪的清洗效果评价参考值: • RLU(相对发光值)<2000为低风险(合格) • 为了遵循ISO持续改进的原则引入风险控制理论: • RLU(相对发光值)2000-4000为中度风险(警告),>4000为高度风险(不合格)
第三部分 临床研究及验证
腔镜器械清洗效果评价 研究对象:腹腔镜(目镜、操作钳、柄钳管腔、穿刺器) 取样:随机抽样30套(拆卸成4个/套,共120个部件) 腔镜清洗方法:按卫生部《内镜清洗消毒技术操作规范(2004年版)》要求 采样时间:清洗前、初洗后、酶浸泡刷洗后、超声清洗后、风吹干或干燥箱后 采样方法:采样面积按国标《医院消毒卫生标准》GB 15982-1995要求; 佩戴无粉、无菌手套及一次性口罩、帽子; 从Ultrasnap试管 中取出拭子,持器械手柄端,在器械表面往 返均匀涂擦各5次。 评价方法: RLU(相对发光值)<2000低风险,2000-4000中度风险,>4000高度风险
分析: 1、 600例检测中,通过初洗、酶洗、超声洗、风吹干燥或干燥炉干燥后ATP含量100%呈下降趋势; 2、整体合格率74%; 3、目镜:由于不能超声清洗,30例平均值5502; 4、柄钳管腔:超声清洗后RLU值升高,经核实由超声清洗机二次污染造成; 5、通过环节控制可找到清洗中薄弱环节; 6、通过环节控制可以提高清洗合格率,符合ISO持续改进的要求。
机械清洗器械效果评价 • 我公司历时2年在全国范围内,对近150家医院的消毒供应中心提供复用医疗器械洁净度检测服务,积累了近5000例检测数据。 • 采样时间:清洗干燥后进行采样; • 采样方法:佩戴无粉、无菌手套及一次性口罩、帽子。 • 非管腔类:从Ultrasanp试管中取出拭子,持器械手柄端,在器械表面横竖往返均匀涂擦各5次,并随之转动拭子,器械齿部和关节部等难清洗的部位可着重涂抹。手拿部位不涂抹,将采样后的拭子放回试管; • 管腔类:在器械表面横竖往返均匀涂擦各5次,并将拭子探入管腔内,往返旋转涂抹5次,拭子从管腔两端各探入9cm,管腔长度小于18cm的采集管腔全部,大于18cm的只采18cm。手拿部位不涂抹,将采样后的拭子放回试管。(拭子无法探 • 入管腔类器械可检测100µl洗脱水并用100µl冲洗用水作阴性对照)。 • 检测: • 掰断拭子上端的速流阀,挤下试剂并振荡15次,放入仪器检测。 • 结果判定: • RLU(相对发光值)<2000合格,2000-4000中度风险,>4000高度风险
检测中发现的问题 1、每次采样以止血钳、宫吸管、弯盘、骨穿针(针柄)、冲洗水 为主,总体合格率为78 %; 2、器械放入清洗机,码放密度不同会影响清洗质量; 3、器械放入清洗机,码放方式不同会影响清洗质量; 4、宫吸管等管腔器械预洗方式不同,会影响清洗质量; 5、骨穿针(针柄)问题较多; 6、RLU(相对发光值)<2000合格,2000-4000中度风险,>4000高度风险的控制指标的提出,使清洗质量有了量化标准和改进的目标,符合ISO持续改进的要求。
采用ATP检测技术院内感染控制流程 血液透析和相关治疗用水 BT-112D 物体表面 手卫生 统计分析 复用医疗器械 BT-112D 有效降低院内感染风险 Plus
内窥镜和手术器械 • “我们得到结论ATP生物荧光法不会完全取代传统生物培养法,但是可以成为复用内窥镜清洗效果的另一新方法。ATP生物荧光法作为传统生物培养法一种快速补充方法发挥其作用。” Hansen et al. Ger Med Sci. 2004; 2: Doc04. Published online 2004 April 26. • “对于最终灭菌前的清洗效果,ATP可以给出快速评估,因为我们知道医疗器械清洗不合格会直接导致消毒灭菌的失败”Obee et al. AJIC (2005) 33, 202-206 • “该试验结果表明手术器械清洗后表面ATP残留可以作为清洁效果评价的一个重要指标,在该领域应用中通过生物萤光方法检测ATP含量是一非常好的技术” Takashina Zentr Steril (2001); 9 (4): 248-258
在感染控制中ATP技术的两种应用 • 总ATP:(细胞外+微生物+体细胞)可做为表面生物污染指标,可充分反应其污染水平。总ATP可以通过用拭子对表面涂抹或将待测物浸入ATP提取液中进行收集。 • 微生物ATP检测:体细胞ATP和游离的ATP可通过特殊试剂有效降解,从而可测出样本中的细菌数量。
ATP技术在医院洁净检测中应用总结 • 检查医疗器械洁净状况 • 检查医院各部位的污染状况和洁净状况 • 手频繁接触物表:治疗车、床栏、床头柜、门把手、灯开关、水龙头等 • ICU等重点部门的环境:各种设备操作表面、供氧设备等 • 其他医疗器械表面:血压计袖带、听诊器、血液透析设备、X线设备等 • 检查医务人员手的卫生状况 • 检测血液透析和相关治疗用水中的微生物 • 对清洁方法或程序进行改进 • 检查医院厨房食品接触表面的洁净状况 • 对医务人员的卫生教育
如何评价ATP检测系统 检测各浓度ATP标准品的线性实验 检测各浓度菌液ATP的线性实验 检测同浓度生物污染ATP的稳定性实验 检测各浓度血液ATP的线性实验
设备和试剂的选择 • 环境和手部卫生评价建议使用 10-15mol ATP的手持设备 • 器械清洁检测和水的检测应该使用高灵敏的设备,同时配备检测能力为10-17mol ATP的高灵敏度试剂 • 标准品可以作为试剂和设备的质控手段
仪器及试剂认证报告 ATP标准物计量报告 BT-112D检测报告 BT-112D计量测试 报告 欧盟 CE认证 美国FDA 认证 PLUS计量测试 报告
Thanks感谢 感谢大会的邀请以及各位专家和老师的聆听如需更多技术支持或探讨请与我们联系