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基因工程技术 Genetic Engineering

Elective Course for Biotechnology. 基因工程技术 Genetic Engineering. Zhongli College of Biological & Environmental Engineering 2007-09-17. 不论地球上的哪一种生命，只要其生命的 DNA 长链优美地打开时，生命创造就开始了。. 第一节 遗传信息的传递 和分子生物学的中心法则. 1958 年英国科学家 Crick 提出并在 1971 年进行了完善的遗传信息传递的 中心法则 (central dogma) 。. 第一章 DNA 分子的复制.

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Presentation Transcript

  1. Elective Course for Biotechnology 基因工程技术Genetic Engineering Zhongli College of Biological & Environmental Engineering 2007-09-17

  2. 不论地球上的哪一种生命，只要其生命的DNA 长链优美地打开时，生命创造就开始了。

  3. 第一节 遗传信息的传递和分子生物学的中心法则 1958年英国科学家Crick提出并在1971年进行了完善的遗传信息传递的中心法则(central dogma)。

  4. 第一章 DNA分子的复制 • DNA分子的忠实而准确的复制和修复机制保证了它作为遗传信息载体不可替代的地位。 即使是最简单的DNA分子，其复制也是一个复杂的、多步骤的过程。 在所有细胞中，DNA的复制都受到严格的控制，而起始复制是受调控的步骤。

  5. 一、 DNA合成的化学基础 两个关键的底物： 脱氧核苷三磷酸(a) 引物-模板接头(b)

  6. DNA合成的机理

  7. 二、 DNA 聚合酶的作用机制 DNA聚合酶催化核苷酸添加需要正确配对的碱基

  8. DNA聚合酶的三维结构类似于一只右手，模板DNA穿过聚合酶DNA聚合酶的三维结构类似于一只右手，模板DNA穿过聚合酶 DNA聚合酶的作用模型

  9. DNA聚合酶以延伸的方式合成DNA

  10. 三、DNA分子复制的一般特点 (1) DNA分子的复制是从特定的位点开始并按特定的方向进行。 DNA分子在复制时并不是随机起始的，而是从特定的位点开始，这个特定的位点就称为复制起始点。 (2) DNA分子的半保留复制 。 复制后，每一个新的双链DNA分子都是由一条母本链和一条新合成的子链组成的。

  11. 2.4 DNA复制叉 Only from end 5’ to end 3’ DNA合成方向？ 前导链(1eading strand) 后随链(1agging strand) 冈崎片段(Okasaki fragment),长度为100-1000 bp

  12. 2.5 DNA聚合酶的特异化 • DNA聚合酶在高效而精确地复制基因组过程中所处的核心地位，要求细胞有多种高度特异化的DNA聚合酶。 所有的原核和真核细胞中都含有几种DNA聚合酶，这些酶协同作用负责染色体DNA的复制、DNA分子损伤的修复、核DNA的重组以及染色体外DNA的复制等。

  13. 例如，原核细胞(如E. coli)中至少有5种DNA聚合酶，这些酶依据其酶学特性、亚基组成和丰度而划分。 其中DNA聚合酶III(DNA Pol III)是DNA复制中涉及的最主要的酶，它由α、β、γ、δ、ε、θ和τ等7个亚基组成。

  14. 在DNA复制过程中，前导链和后随链是由具有不同聚合酶活性的酶进行复制的，然而原核生物中只有DNA聚合酶III为复制酶，如何解决这一问题呢？在DNA复制过程中，前导链和后随链是由具有不同聚合酶活性的酶进行复制的，然而原核生物中只有DNA聚合酶III为复制酶，如何解决这一问题呢？ • DNA聚合酶III核心酶的三个亚基(α、ε、θ)，无论在合成前导链或后随链的DNA聚合酶中都是相同的，此核心酶通过与不同的亚基结合装配成特性不同的DNA聚合酶III全酶复合物(DNA Pol III holoenzyme)，以使它们具有分别复制前导链和后随链的能力。而且，全酶具有很高的延伸能力。

  15. DNA聚合酶I(DNA Pol I)专门用于除去起始DNA合成所需的RNA引物。 • 5’外切核酸酶的活性 • 延伸能力不强

  16. 真核细胞中也有多种DNA聚合酶，通常有15种以上。其中对于基因组的复制至关重要的有3种：DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε以及DNA聚合酶α/引物酶。真核细胞中也有多种DNA聚合酶，通常有15种以上。其中对于基因组的复制至关重要的有3种：DNA聚合酶δ、DNA聚合酶ε以及DNA聚合酶α/引物酶。 聚合酶α是核DNA复制的重要酶之一，并且与引物酶密切结合，负责新DNA链合成的起始。引物酶合成RNA引物后，所产生的RNA引物-模板接头立即与DNA聚合酶α结合，以启动DNA的合成。 因为DNA聚合酶α/引物酶的延伸能力相对较低，所以在DNA合成起始后很快就被高延伸性的DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代。DNA聚合酶δ或聚合酶ε取代DNA聚合酶α/引物酶的过程称为聚合酶的切换(polymerase switching)

  17. 真核细胞DNA复制过程中DNA聚合酶的切换。 通常DNA聚合酶α/引物酶的产物为50-100bp，由聚合酶δ或聚合酶ε进一步延伸至100-10000bp。虽然DNA聚合酶δ和聚合酶ε都能替代DNA聚合酶α/引物酶，但它们似乎是在特定DNA(前导链和后随链)的复制过程中起作用。

  18. DNA聚合酶在复制叉上具有高延伸能力的关键在于它们与被称为滑动DNA夹(sliding clamp)的蛋白质间的结合。 • 这些蛋白质由多个相同的亚基组成，并组装成“油圈饼”(donut)的形状，夹子中央的孔洞大得足以环绕DNA。 聚合酶与滑动夹形成的复合体在DNA合成时沿着DNA模板高效地移动。

  19. 滑动DNA夹 滑动DNA夹增强了与其结合的DNA聚合酶的延伸能力

  20. 六、 DNA复制的起始 • 复制叉最初的形成需要DNA双链的分离，为RNA引物及新的DNA的合成提供模板。 • 虽然DNA链的分离(即DNA解旋)在染色体末端最容易进行，但是DNA分子的合成通常是在中间区域开始的。 • DNA解旋和复制起始发生的特殊位点称为复制起始位点(origin of replication)。在不同的生物中，每个染色体上可有一千至数千个起始位点。

  21. 复制起始的复制子模型 • 1963年,Francois Jacob、Sydney Brenner以及Jacques Cuzin提出所有的DNA都是从被称为复制子(replicon)的特定的起始位点开始复制的。 例如，E. coli中的单条染色体只有一个复制起始位点，所以整个染色体是一个复制子。相反，多个复制起始位点的存在将每个真核染色体分成多个复制子，每个复制子都有一个复制起始位点。

  22. 复制子模型 起始子蛋白基因编码起始子蛋白，通过激活复制器引发了复制的起始和相连DNA的复制。 上图: Jacob等提出的模型； 下图: Huberman提出的扩展后模型。 控制复制起始的有两个元件： 复制器(replicator)和起始子(initiator)。

  23. 图中为3个研究比较透彻的复制子的DNA元件组成。图中为3个研究比较透彻的复制子的DNA元件组成。 • oriC由4个9bp的DnaA结合位点和3个13bp的重复元件构成，后者是起始DNA解旋的部位。 • 真核病毒SV40的复制起始位点，由4个“T抗原”起始子蛋白结合位点(P)和一个回文序列(EP)构成，后者DNA解旋的部位。 • 在酵母复制器上常见3种元件，A元件、B1元件与起始子ORC结合，B2元件促进DNA的解旋和与其它复制因子的结合。 复制器的结构

  24. 2.7 各种各样的复制子和多种多样的复制起始机制 • 生物的多样性也反映在DNA复制方式的多样性。 • 由蛋白质引发的复制起始 • 失控及可控滚环复制的模式 • 单向复制模式 • 双向线性复制模式

  25. 2.8 结合和解旋

  26. 起始子蛋白对复制起始位点的选择和激活 • 在复制起始过程中，起始子蛋白一般执行以下三种功能。 第一，这些蛋白与复制器中的特异DNA序列结合； 第二，一旦与DNA结合，它们就扭曲或解旋其结合位点附件的DNA区域； 第三，起始子蛋白与复制起始所需的其它因子相互作用，使它们聚集到复制器上。

  27. DNA复制起始期间起始子蛋白的功能 图示为起始子蛋白三种常见功能：与DNA结合、 导致DNA链分离、复制蛋白的募集。

  28. 在真核细胞中，起始子是一个被称为起始位点识别复合体(origin recognition complex，ORC)的六蛋白复合体

  29. E. coli DNA复制起始的模型 a. 多个DnaA-ATP蛋白结合到oriC内的9bp重复序列上。b. DnaA-ATP与这些序列的结合导致DNA链在13bp单位重复处分离。c. 与DnaA结合的DNA解旋酶(DnaB)和解旋酶装载器(DnaC)与起始位点结合。d. DNA解旋酶装载器催化DNA解旋酶蛋白环的打开、以及蛋白环在单链DNA起始位点上的套装。DNA解旋酶的安装导致解旋酶装载器从复制器上解离下来，并激活DNA解旋酶。e. 每个DNA解旋酶召集一个DNA引物酶，DNA引物酶在各模板上合成一条RNA引物。f. 新合成的引物被两个DNA聚合酶III全酶中的夹子装载器元件识别。滑动夹在每条引物上组装，前导链合成开始。g. 当各个DNA解旋酶运动约1000bp之后，在各自的后随链模板上合成第二条RNA引物，并装载滑动夹。产生的引物-模板接头被第二个DNA聚合酶III全酶识别，导致后随链合成的启动。h. 现在，各个复制叉上的前导链和后随链合成都已启动，并将持续到模板的末端或遇到邻近复制起始位点产生的另一个复制叉为止。

  30. 复制复合体(pre-RC)的形成。 pre-RC的组装是一个有序的过程，它先被ORC识别，然后募集到两个解旋酶装载蛋白：Cdc6和Cdtl。最后这三个蛋白共同募集真核DNA解旋酶Mcm2-7，完成pre-RC的组装。

  31. 真核和原核生物DNA复制起始的相似性 • 第一步是起始子蛋白对复制器的识别。起始子蛋白和一个或多个解旋酶装载器蛋白共同将DNA解旋酶募集到复制器上。解旋酶(和真核细胞中起始位点上其它潜在的蛋白质)产生单链DNA区域作为RNA引物合成的模板。当引物合成后，复制体的其它元件通过与形成的引物-模板接头的相互作用进行组装。

  32. 2.9 DNA复制是一个复杂的调控过程 • 在细胞内所进行的DNA复制绝不是DNA聚合酶单独完成的过程，而是一个复杂的调控过程。在这种调控过程中，对复制起始的调控是关键的环节。现在已知很多因素参与DNA的复制起始的调控。

  33. 2.9.1 甲基化对复制起始的调控 • 无论是细菌还是较高等的生物，在每个细胞周期中只允许每个复制子有一次起始。那么是什么机制来控制一个复制子在一个细胞周期中只能启动一次复制起始呢？ • 在E. coli中，通过禁止新复制的复制起始点ori C重新启动，而防止染色体复制发生意外。新复制的ori C具有独特的甲基化状态，它在复制后不久亲本链被一种称为Dam甲基转移酶甲基化，但子链不被甲基化，因此对双链来说，属于半甲基化。

  34. 2.9.2 细胞周期的激酶(Cdk)调控真核细胞前复制复合体的形成和解离 • 那么，是什么机制控制真核细胞中的每个复制子在每个S期只有一次复制起始呢？答案在于细胞周期调控蛋白依赖性激酶(Cdk)对前复制复合体(pre-RC)的形成和活化进行的严谨的调控。

  35. Cdk对pre-RC的形成和活性的调控 高活性Cdk是已有pre-RC复合体启动DNA复制所必需的，但是Cdk的高活性同时也抑制新的pre-RC的形成；相反，Cdk的低活性有利于pre-RC的形成，却不足以激活新合成的pre-RC引发DNA复制起始。

  36. Cdk活性和pre-RC形成的细胞周期调控 在G1期，Cdk水平低，pre-RC虽能形成但不能被激活。在S期，高活性Cdk引发DNA复制的起始，并阻止新的pre-RC复合体的形成。pre-RC复合体用于复制起始之后就解离。只有在细胞分裂后，才形成新的pre-RC复合体。

  37. 2.11 DNA分子复制具有高度的精确性和准确性 • DNA分子在细胞内的复制速度相当快，在细菌中为104-105个核苷酸/min，而在真核细胞中(如哺乳动物细胞)为500-5000个核苷酸/min。表面上看，DNA在哺乳动物细胞中的复制速度比细菌慢，但在真核细胞中DNA分子有多个复制起始点，从而保证了DNA分子的快速复制。是什么因素使DNA分子的复制具有高度的忠实性和准确性呢?

  38. 四种可能的机制 (a) DNA聚合酶具有选择正确的脱氧核苷三磷酸的能力； (b) 可能存在一个核对机制(checking mechanism)，通过这种机制拒绝不正确的核苷酸进入。这种对核苷酸识别能力的提高可能是由于模板诱发DNA聚合酶构象发生变化，只允许选择正确的脱氧核苷酸底物，或者在存在互补的核苷酸时，增加了酶对模板的结合；

  39. (c)动力学校对模型(proofreading mechanism)。当脱氧核苷酸作为底物进行DNA链合成时，随着焦磷酸的释放，形成了酶┅模板┅dNTP高能复合物。DNA聚合酶具有对此复合物核对的能力，检查掺入的核苷酸是否正确。这个核苷酸(dNTP)这时可能被释放，但错误的核苷酸被释放的机会远远高于正确核苷酸。这就是所谓的动力学校对模型； (d) DNA聚合酶除具有聚合酶活性外，还具有5’→3’和3’→5’的外切酶活性。DNA聚合酶的3’→5’的外切酶活性可以随时将已经掺入的错配的脱氧核糖核苷酸从延伸的多核苷酸链上除去，保证DNA复制的忠实性和准确性。

  40. DNA分子也会由于外界条件的作用而受到损伤，防止DNA分子损伤是由细胞内存在的DNA修复酶(DNA聚合酶的一种)承担的。在细胞内它们不断地查寻DNA分子什么地方被损坏，一旦发现，就及时清除。DNA聚合酶的忠实复制、校对和修复功能保证了作为遗传信息载体的DNA分子的高度稳定性。值得指出的是，这里强调DNA分子的稳定性并不是说作为遗传信息的载体，DNA(基因)永远是一成不变。基因的突变-自然选择，则是生命有机体不断进化的原动力。

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