ניתוח מאפייני מבנה שניוני של מולקולות ה- H/ACA-like snoRNA בטריפנוזומטידים

1. ניתוח מאפייני מבנה שניוני של מולקולות ה- H/ACA-like snoRNAבטריפנוזומטידים מאת: אינה מיסליוק אביחי אפטוב בהנחיית: פרופסור שולמית מיכאלי

2. הטריפנוזומטידים הטריפנוזומטידים הינם אאוקריוטים חד תאיים ירודים שהתפלגו מוקדם מהענף האאוקריוטי. הם מהווים פרזיטים של בעלי חוליות, חסרי חוליות וצמחים. חלקם פתוגניים וגורמי מחלות באדם.

3. הטריפנוזומטידים טריפנוזומה ברוסיי (Tripanosoma brucei), אחד הנחקרים במעבדה, גורם למחלת השינה באדם ולמחלות נוספות בבקר. הטפיל מחלק את מחזור חייו אצל חרק (זבוב הצצה) ואצל יונק. על מנת לשרוד את שינויי התנאים במעבר מן החרק ליונק התפתחו בטפיל מנגנונים יחודיים. תהליך ה-Pre-mRNA trans-splicing וחלוקה ייחודית של תת-היחידות בבניית הריבוזום הן דוגמאות לייחודם של הטפילים (Handman et al., 1995).

4. רקע מולקולרי כאשר בוחנים את הרכב ה-RNA בתא מתברר כי רובו הוא tRNA ו-rRNA, רק אחוזים ספורים מהווים את חלקו של ה-mRNA. בשנים האחרונות מתגלות ונחקרות מולקולות RNA קטנות "חדשות". מולקולות אלה אינן מקדדות לחלבון, פועלות בשיתוף עם חלבונים בצורת קומפלקסים מעורבים - RNPs. המולקולות אותן אנו חקרנו בפרויקט הינן H/ACA-like box snoRNA. מולקולות אלה הן מסוג Guide snoRNA, כלומר מולקולות אשר מהוות חלק מקומפלקס RNP ומכוונות את הקומפלקס למקום הפעילות המדויק שלו. הקומפלקס מבצע מודיפיקציות על rRNA ופועל בגרעינון.

5. תמונה זו מייצגת את אחת מיחידות ה-rRNA של T.brucei. בצבע, מקומות שעוברים מודיפיקציה. בירוק, אתרי מודיפיקציה יחודיים לטריפנוזומה. המספר הגדול של מודיפיקציות על ה- rRNA דומה לזה שקיים בצמחים ומשויך לשינויים הקיצוניים בטמפרטורה איתן האורגניזם מתמודד. From: Liang X-h et al., Trypanosome C/D and H/ACA-like RNAs

6. פעילות המולקולה יורידין עובר מודיפיקציה לפסאודויורידין ובכך מתאפשרת יצירת קשר מימן נוסף שתורם לחוזק הריבוזום. Ψ

7. מבנה ותפקוד המולקולה H/ACA-like box snoRNA • אורך המולקולה כ-70 נוקליאוטידים. • קופסת ה-AGA - הרצף הראשוני היחיד שהוכח כי חשוב לקישור בין החלבונים • למולקולה והיחיד שנמצא משותף לכלל המולקולות. Down Stem – loop + pseudouridylation pocket – stem – loop Up

8. חיפוש גנומי של המולקולות קיימת הערכה כי צריכים להימצא בטריפנוזומטידים כ-100 מולקולות H/ACA-like שונות. בידינו כיום כ-30 מולקולות לזנים מרכזיים. מרביתן נמצאו בסמיכות לגן אחר מסוג C/D Guide snoRNA, אשר קל יחסית לחפשו בגנום. לא קיימת כיום תוכנה שמסוגלת לאתר את מולקולות הH/ACA-like – בטריפנוזומטידים בשל החלוקה לשניים של רצף ההכרה, היותו קצר מלכתחילה ואי קיומו של רצף קונצנזוס די ארוך. ניסיונות חיפוש של מולקולות אלה על גנום שלם נעשים במעבדה של פרופסור אונגר, עד כה ללא הצלחה מזהירה. בפרויקט שלנו התמקדנו בניסיון למצוא חוקיות במבנם השניוני של רצפי ה- H/ACA-like. תוספת חוקי חיפוש בסיסיים יכולה למקד את התוכנה ולסנן החוצה תוצאות False Positive.

9. שלבי הפרויקט • איסוף מולקולות והכנת מאגר של מספר זנים: • T.Brucei • T.Cruzi • T.Vivax • T.Congolense • L.Major • L.Infantum • חיפוש חוקים חדשים.

10. Blast שלבי איסוף והכנת המולקולות למחקר ClustalW + needle mfold Primary DB Homology DB Canvas + Vienna files Graphic 2° structure files

11. שימוש בתוצאות ללימוד Graphic 2° structure files • ביצוע סטטיסטיקות על המבנה השניוני (גודל stems, הופעת • נוקליאוטידים שונים במיקומי מפתח, חיפוש K-turn ועוד). • שילוב התוצאות • זיהוי האזורים השמורים במבנה השניוני לפי השוואה בין • הומולוגים על גבי תמונות המבנה השניוני. + ClustalW + needle • לימוד יחסי הומולוגיה בין מולקולות. • ניחוש רצפי הכרה של המולקולות.

12. Blast http://www.genedb.org/ http://www.sanger.ac.uk/Projects/ • מה מחפשים? כמה שיותר מולקולות בזנים מספיק רחוקים. • מתי מחפשים? תלוי בהתקדמות פרויקט הריצוף של הזן. T.Congolense - initially to a 1x coverage. T.Vivax - The current coverage is 5x. L.Major - sequencing complete, 2 small gaps remaining. L.Infantum - ~5x coverage in progress. T.Brucei progress:

13. Blast • התהליך • חיפוש בעזרת רצף ידוע ( T.brucei, T.cruzi, L.major). • סינון התוצאות לפי התאמה מירבית ו- E value. • במידה והרצף המתקבל הינו על הגדיל המשלים (אין AGA בסוף אלא TCT • בהתחלה) הפכנו את הרצף בעזרת כלי שכתבנו. • קביעת שם לרצף ושמירה במאגר הנתונים. • התוצאות • תוצאות החיפוש: 0 L.major חדשים, 22 T.vivax חדשים, 25T.congolense • חדשים ו-32L.infantum חדשים. • יחד עם עוד 34 מולקולות של T.brucei, 32 מולקולות T.cruzi ו-32 • מולקולות L.major, מהוות תוצאות החיפוש את ה-Primary DB עליו עבדנו.

14. ClustalW http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ Needle(Needleman-Wunsch global alignment) Under: http://www.agri.huji.ac.il/EMBOSS/ Or directly: http://www.agri.huji.ac.il/emboss-bin/emboss.pl?_action= input&_app=needle

15. ClustalW • השימוש הראשון שעשינו בתוכנה היה לצורך ניקוי תוצאות ה-Blast. • הרצף הראשוני של מולקולות ה-H/ACA-like חסר חשיבות בפני עצמו ולכן • השונות, בין מולקולות שאינן הומולוגיות, רבה. • הרצנו קבוצת מולקולות מאותו זן בתוכנה והשתמשנו בטבלת הציונים • שהתוכנה מספקת. בטבלה זו מוצגות כל ההשוואות בין כל זוגות הרצפים • האפשריים מתוך הקלט. קבוצה "נקייה" של מולקולות נותנת ציוני דמיון בין • 10 ל-50 אחוז בין הזוגות השונים. • ברצפים שקיבלנו מה- Blast ניתן היה למצוא גם זוגות רצפים בעלי 90% • דמיון בינם לבין עצמם. זוגות כאלה נבדלים ב- 2-3 מוטציות וסוננו • מתוצאות ה- Blast.

16. ClustalW • בשלב הבא יצרנו טבלאות הומולוגיות לרצפי T.vivax ו- L.major. • על מנת ליצור טבלה הרצנו, למשל, את כל רצפי L.major כנגד כל רצפי • T.brucei. וקבענו מי הומולוג למי במידת האפשר. • בשלב הבא הרצנו את כל רצפי L.major כנגד T.cruzi וכך הלאה. • כל טבלת הומולוגים שהתקבלה בסופו של דבר הכילה 4 זנים ובוצעה • סביב זן אחד מרכזי (L.major בדוגמא). • * החל מנקודה זו התמקדנו ב- L.major וב- T.vivaxבהכוונתה של פרופ' • שולמית.

17. ClustalW Homology DB • כל רביעיית הומולוגים שזיהינו בשלב הקודם הרצנו שוב ב- ClustalW. • דוגמא לפלט התוכנה: 4265315.c000538791.Contig1_324 GCCATCCCCTTTAATAGCGAGCAG-CCCTACGTGCATCACCGCGAGCGGC TC10C1H1 --CATCCCCTTTAATAGCGAGCGGACCCTCAGTGCGTCACCGCGAGCCGC TB10C1H1 -TCATCCCCTTTAATAGCGAGTGGTCTTTGTGTGCATCTCCGCAAACCAC Tviv_chr10_1509417_1509487 ---ATCCCCTTAGACAGCGAGCAGCACGCCTGTGCGTTCCCGCAAGCCGC ******** * ****** * **** * **** * * * 4265315.c000538791.Contig1_324 TCGTCTACACCGGGGGAGAGAT—- TC10C1H1 TCGTCTACACCGGGGGAGA----- TB10C1H1 TCGTCTACACCGGGGGAAAGATAA Tviv_chr10_1509417_1509487 TCGTCTACACCGGGGGAGAGAGAA ***************** * • כבר בשלב זה ניתן לראות, פחות או יותר, שאגפי המולקולה יותר שמורים ממרכזה. • אזורים אלה מכילים את ה-stems ואת הלולאה הראשונה בה נמצא רצף ההכרה.

18. needle Homology DB • תוכנת needle מבצעת Global Alignment בין זוג רצפים. • השתמשנו בתוכנה זו במקרים בהם לא הצלחנו לבצע Alignment טוב בין • הומולוגים, בשל האילוצים החלים על ClustalW בתור תוכנה המבצעת התאמה • בין רצפים רבים. • needle מאפשרת שליטה רבה יותר בפרמטרים וכוונון משופר של ההתאמה • בין זוג רצפים. פלט לדוגמא: LM35C1H1 1 GTGCGGCCCACATTGGAGTTGTGTCCTGGCCCCA----GCAGTGGCCCTG ..|||||||||||||||||||||.|||.|..| .|.|||.||.|| TB9C2H1 1 AAGGCCCACATTGGAGTTGTGTCTTGGGCTAACATTTCTGTGTCCTTG LM35C1H1 47 TCTGCACACTCGCGTGGGCCAAGAGAT 73 |.|||||||||.|||||.||.|||..| TB9C2H1 49 TTTGCACACTCACGTGGTCCGAGAATT 75

19. mfold http://www.bioinfo.rpi.edu/applications/mfold/old/rna/form1.cgi • קיפול רצפי L.majorורצפי T.vivax למבנה שניוני. • הקיפול מותנה ביכולת שלנו להגביל את התוכנה mfold מלבצע base pairing • כרצונה. בדרך כלל פלט התוכנית אינו מתאים למבנה המצופה של המולקולה. • (מיד יודגם). • תמונות הקיפול המתקבלות ב-mfold אינן מיצגות קיפול "אמיתי" ודורשות • תיקונים. • את תוצאות הקיפול שמרנו הן כתמונה והן כקובץ Vienna. בקובץ זה השתמשנו • מאוחריותר לבניית מבנה שניוני חדש למולקולה בתוכנהCanvas . • דוגמא לקובץ Vienna: • TV10C1H3 • GCAGGAACGUGGCAGGCCAAUGAGUGCGCACUCGUCUCUCAUGUGGUUCAACAACAUGGUCCGAGACUUG • ...(((.((((....(((((((((.(((....)))..))))).)))).......)))).)))........

20. הרצת mfold בלי מגבלות: קלט: LM35C4H1UUGCGGUGAAGCGGCUUUAGCCUUGGCGCGGCUUUCACACCCCUGUGCCGUGUGCCAUCUUGGUGCGCCUCGAGAUCG פלט 1: פלט 2: אוי ווי

21. מגבלות על mfold • ניתן להכריח את mfold לזווג זוג נוקליאוטידים או לאסור על זיווגם. • מגבלות יצרנו בעזרת: • א. רצפי הכרה (אלה שמזהים את ה-rRNA) שקיבלנו מהמעבדה: • ב. רצפי הכרה שניחשנו על סמך הומולוגיה בין רצפים: • LM36C3H4 • LM36C3H4 --------AGCAGTGTCGCTATGCGTCTCCGTCTCACCTCGATGCGGAGC • LInfant_CntGDB3661_1120_1184 --------AGCAGTGTCGCTATGCGTCTCCGTCTCACCTCGGTGCGGAGC • TB10C3H1 --------AGCAGTGTCGCTATGCGTTCCCGTC----AGTAATACGGGCT • TC10C3H1 GCCGAGGCAGCGGTGTCGCTATGCGTCCCCGCA----GACAGTGCGGTGC • *** ************** *** * *** • LM36C3H4 AACGGTACGAAACACGTGCGAGATGC • LInfant_CntGDB3661_1120_1184 AACGGTACGAAACACGTGCGAGA--- • TB10C3H1 AACGGTACGAAGCACGTGCGAGAGGT • TC10C3H1 GACGGTACGAAGCACGCGCGAGAGCC • ********** **** ****** • בדוגמא הנ"ל ידענו מהו אתר הפעילות של T.brucei, ולפי ההומולוגיה • החזקה עם L.major ניחשנו את רצף ההכרה וקיפלנו לפיו.

22. הרצת mfold עם מגבלות: קלט: LM35C4H1 UUGCGGUGAAGCGGCUUUAGCCUUGGCGCGGCUUUCACACCCCUGUGCCGUGUGCCAUCUUGGUGCGCCUCGAGAUCG P 20 0 3 P 59 0 8 P 73 0 3 פלט: הצלוחע

23. האומנם?

24. ובכן... • לא כל מה שטוב ל- mfold טוב למולקולה: • בולג'ים שקולים. • הסטה של צד אחד מה-stem. • בולג' כנגד פתיחה מוקדמת • של לולאה. • ועוד... לכן, על מנת לקבל תמונה נכונה של המולקולה בטרם המחקר, השתמשנו בתוכנת הגרפיקה Canvas כדי ליצור תמונות של המולקולות באופן ידני.

25. Tviv_chr9_2334096_2334166 CTTCTGGTAGTCGCGGAGATGC TC9C1H2 CTTCTGGTAGTCCCGGAGATGA TB9C1H2 CTTCTGGTGGCTCCGGAGAAGC 4265315.c000214879.Contig1_197 CTTCTGGTAGTTCCGGAGATG- ******** * ****** * ACACGUGACAAUCCGAGGUGCGUGCGCGUCUUCCAUGCCACGUGAUUUCCUUCUGGUAGUCGCGGAGAUGC ...((((((......(((((((((.((((.....))))))))))....))).......))))))....... תמונות ה- Canvas שיצרנו משלבות את המידע הקיים ב-Homology DB יחד עם קבצי ה-Vienna שמייצגים את תמונות ה-mfold. מספר המולקולות בפורמט הסופי קטן בגלל הומולוגיה חלשה או אי הצלחה בקיפול המולקולות. בצבע - ההומולוגים ומקום המוטציה. בפונט Italic - נוקליאוטידים שלא הושוו עם ההומולוגים. נמצאים באזורים בהם קיימות מוטציות רבות מאוד.

26. השוואת המולקולות ההומולוגיות על גבי התמונה מאפשרות בראש ובראשונה להבחין בחשיבות המבנים השניוניים השונים במולקולה. Compensatory mutations ב- stem התחתון תומכות בחשיבותו לתפקוד המולקולה. הלולאה האמצעית שמורה בחלקה, רצף ההכרה שמור, שאר הלולאה לא. ה-stem השני שמור בחלקו, החלק שקרוב לכיס הפסאודויורידילציה שמור ככל שעולים מתחיל הבלגאן. הלולאה האחרונה אינה שמורה כלל וגודלה משתנה מאוד.

27. חיפוש חוקים • החוקים הידועים • קופסת AGA בצד 3’ של המולקולה. • stem ראשון עם אפשרות לבליטה יחידה. • מרווח של נוקליאוטיד אחד בין AGA ל-stem . • מרחק 14-16 נוקליאוטידים בין AGA לכיס ה-Ψ. • stem נוסף באורך מינימלי של 3 bp. • אורך כללי של המולקולה בין 55 ל-75 נוקליאוטידים. • בעזרת חוקים אלה נמצאות מאות של "מולקולות". • עבור כל אזור מודיפיקציה על גבי ה- rRNA • מוצעות 5-6 מולקולות עם סבירות נמוכה למצוא • אחת נכונה.

28. חיפוש חוקים על ידי בדיקות סטטיסטיקות • בירור מעמיק של אורכי חלקי המולקולה. • חיפוש נוקליאוטידים משמעותיים בזנבות המולקולה (מצדדי • ה-stem התחתון). • בדיקה מעמיקה של הבליטות ב- stem הראשון. • נפוצות וסוג המוטציות. • אורך רצפי ההכרה.

29. אורכי חלקי המולקולה מספר נוקליאוטידים בלולאה האמצעית אורך stem שני אורך stem ראשון אורך כולל טווח – 2-8 ממוצע – 4.3 סטיית תקן – 1.4 טווח – 4-7 ממוצע – 6.2 סטיית תקן – 0.8 טווח – 64-87 ממוצע – 71.5 סטיית תקן – 5.22 טווח – 9-16 ממוצע – 12.5 סטיית תקן – 1.9 אורך החלק מעל הלולאה האמצעית אורך עד ללולאה אמצעית (כולל) טווח – 29-52 ממוצע – 35.75 סטיית תקן – 5 טווח – 21-29 ממוצע – 25.5 סטיית תקן – 1.6 מרחק בין AGA לכיס הפסאודויורידילציה מרחק בין AGA ל- stem הראשון טווח – 13-16 ממוצע – 14.8 סטיית תקן – 0.9 1 בלבד

30. מסקנות • אורך המולקולה הוא לא פרמטר טוב, רק אורך חציה • התחתון. • למעט מקרה יחיד של מולקולת H/ACA-like • המכוונת מודיפיקציה על Spliced-Leader snRNA • ולא על rRNA, תמיד קיים רווח של נוקליאוטיד 1 • בלבד בין AGA ל-stem הראשון. • לגבי שאר התכונות הנמדדות - לא רק שלא מיקדנו • את התוכנה על חוקים ברורים אף הגדלנו את טווח • החיפוש שלה... • כנ"ל לגבי אורך רצפי ההכרה, שלא הוצג • בשקף הקודם

31. מוטציות ובליטות מוטציות שאינן compensatory mutations ב- stem הראשון הן נדירות. מהשוואת L.major עם T.brucei ו- T.cruzi עולה כי יש 85% סיכוי שתהיה מוטציה בין הזנים, אך רק 25% סיכוי שמוטציה זו תהיה מוטציה לא מפצה. מוטציות ב- stem הראשון יכולות לגרום להיווצרות בליטות (בולג'ים). המולקולה יכולה לסבול בולג' אחד בלבד ב- stem. הבליטות עוברות מוטציות רבות שאינן מפצות, מכאן שהן חסרות חשיבות. מוטציות ב- stem השני שמופיעות בגובה 1-3bp הן בהכרח מפצות.

32. תוצאות ומסקנות • אחוזי המוטציות לא תורמים לתוכנת החיפוש אך • מדגימים את חשיבות ה- stems. • בליטות ב- stem הראשון יכולות להמצא בכל מקום • על ה- stem ולהכיל לכל היותר נוקליאוטיד אחד • מכל צד. • בליטות או מוטציות שאינן מפצות ב- stem השני • מעידות על סיומו. בליטות כאלה מכילות בדרך כלל • יותר מנוקליאוטיד אחד. • הן הבליטות והן המוטציות מופיעות רק לאחר 3 צמדי • בסיסים של ה- stem.

33. חיפוש נוקליאוטידים משמעותיים בזנבות המולקולה Logo’s website: http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi הפעם ניתחנו 79 מולקולות מהזנים L.major, T.brucei ו- T.cruzi חוק ראשון – נדיר ביותר למצוא U ליד משמאל ל-AGA או בשני המקומות משמאל ל- stem. חוק שני – G לא מופיע אף פעם מיד משמאל ל- stem.

34. רק A משמאל רק C משמאל חוק שלישי – הנוקליאוטיד שסמוך ל-AGA לעולם לא יעבור זיווג עם הנוקליאוטיד שצמוד ל- stem. לאן נעלם ה-G? נדיר ב- T.brucei 6% נפוץ בL.major - 30%

35. תת חוק של חוק שלישי – אם מופיע G ליד AGA אזי גם זיווג G-U לא מקובל. • קיימת חריגה של הופעת U מול G במולקולה אחת. הופעת U במקום זה • היא ענין נדיר בפני עצמו, ולא הצלחנו לשלול את נכונות המולקולה החריגה. • בשאר המיקומים שנבדקו יש פיזור די אחיד של הנוקליאוטידים.

36. מסקנות חוק ראשון – נדיר ביותר למצוא U ליד משמאל ל-AGA או בשני המקומות משמאל ל- stem. חוק שני – G לא מופיע אף פעם מיד משמאל ל- stem. חוק שלישי – הנוקליאוטיד שסמוך ל-AGA לעולם לא יעבור זיווג עם הנוקליאוטיד שצמוד ל- stem. חוק רביעי – G ליד AGA גורר A ליד ה- stem

37. Kink-turn בקצרה • מוטיב שהתגלה ממש לאחרונה המופיע במולקולות RNA קטנות כולל H/ACA snoRNA. • לא אותר במולקולות של טריפנוזומטידים עד כה. גם לא על ידינו. • אותר בארכיאה כשסמוך לו מופיע רצף GAG על הלולאה העליונה. • בכוונתנו לחפש את רצף זה או רצף דומה בעזרת כלי • בשפת סקריפט.

38. מה עושים עם זה? • החוקים והתופעות הסטטיסטיות שמצאנו יכולים כבר עכשיו להשתלב בתוכנת החיפוש כפי שהיא. • רשת נוירונים יכולה לסייע במתן משקל לתכונות השונות. • אלגוריתם clustering יכול לסייע במציאת קשר בין תכונות ויצירת קבוצות של מולקולות שתאפשרנה חיפוש ממוקד יותר.

39. תודה על ההקשבה!