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第 三 节 核 酸 序 列 分 析 Nucleic Acid Sequence Analysis 钟树荣副教授 昆明医科大学法医学院. DNA 序列测定（ Determination of DNA sequence ）. 核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。
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第 三 节 核 酸 序 列 分 析Nucleic Acid Sequence Analysis钟树荣副教授 昆明医科大学法医学院
DNA序列测定（Determination of DNA sequence） 核酸DNA分子一级结构的测定，是现代分子生物学一项重要的技术。 1963年，Sanger和Thompson等人第一次完成胰岛素51个氨基酸的序列测定，这在当时来说是一件了不起的大事。70年代后期，Sanger和Maxam----Gilbert等人又建立了核酸序列测定的方法，Sanger双脱氧末端终止法和Maxam----Gilbert化学裂解法将核酸序列测定技术推进到“直读”阶段，使核酸序列测定变得远比蛋白质氨基酸序列测定容易，这样人们可以通过核酸序列和遗传密码推导出蛋白质氨基酸的序列。
测序（sequencing）的常用方法 DNA序列测定常用方法有如下3种：
一、化学裂解法(Maxam-Gillbert法) 基本原理 Maxam-Gilbert法(1977年）要对原DNA进行化学降解。即用化学试剂在A、G、C、T处特定地裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链（等差数列 n=1），经过PAGE和放射自显影后，可以直接读出DNA的顺序。
化学裂解法测序（Chemical pyrolysis sequencing）的原理 1、用放射性核素标记待测DNA一侧末端 2、将标记DNA分为G、A+G、C+T、C 4个反应体系 3、用不同的化学试剂处理不同反应体系，随机断裂DNA片段某种碱基中的任何一个，产生一组一端为放射线标记的末端，另一端为不同大小的DNA片段的混合物 4、电泳分离，放射自显影得到互相错落的梯形图谱，即可读出DNA序列
在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是：在4种反应体系中，化学试剂特异地断裂DNA的机制是： G反应----硫酸二甲酯（DMS）使GN7甲基化，其后断开了C8-C9间的化学键，哌啶置换了被修饰鸟嘌呤与核糖的结合。 G+A反应----（哌啶）甲酸使嘌呤环上氮原子质子化，削弱了嘌呤脱氧核糖核苷酸和腺嘌呤脱氧核糖核苷酸的糖苷键，然后哌啶置换了嘌呤。 T+C反应----肼断开了嘧啶环，产生碱基片段被哌啶置换。 C反应----在NaCl存在时，只有C才能与肼发生反应，随后，被修饰的胞嘧啶被哌啶置换。
碱基特异性修饰及裂解 （Base specific modifications and cracking）
化学法测序（Chemical method of sequencing ）的基本步骤 （一）限制酶消化待测DNA，得到长度为100-200bp的一组片段，纯化回收每1个片段作为测序材料。 （二）碱性磷酸酶处理消除5’磷酸。 （三）多核苷酸酶催32PdNTP标记（5’-OH）末端。 （四）使标记片段变性为单链。 （五）分成4-5个反应体系，按上述程序（表或4个机制）化学处理，严格控制反应条件。（使得平均每1个DNA分子只有1个位置被断裂，这种断裂是随机的，如G反应，则在DNA链上任意位置G断裂），DNA链上每50-100碱基只有1个被裂解，这样，每个反应中虽然都在同一核苷酸处断裂DNA链，但由于碱基位置不同，产生1组不同长度的DNA片段。其长度可由几个核苷酸到接近待测DNA全长。 （六）电泳 （七）放射自显影 （八）4个反应管统一阅读，DNA4个碱基每个位置都有一个相应的片段，待测DNA全部核苷酸序列就可直接读出。
二、Sanger双脱氧链终止法 在DNA合成时，利用ddNTP与dNTP竞争掺入到新生的DNA链上使链终止的原理。即在A、C、G、T 4种反应体系中，分别加入不同的ddNTP，其他试剂相同，经酶促合成反应，生成具有相同的5′末端，而3′不同的DNA片段的混合物。经电泳分离，放射自显影，直接读出DNA的核苷酸序列。
Sanger双脱氧链终止法（Sanger dideoxy chain termination method ）
三、DNA自动测序（automatic DNA sequencing） 采用荧光替代放射性核素标记是实现DNA序列分析自动化的基础。用不同荧光分子标记四种双脱氧核苷酸，然后进行Sanger测序反应，反应产物经电泳（平板电泳或毛细管电泳）分离后，通过四种激光激发不同大小DNA片段上的荧光分子使之发射出四种不同波长荧光，检测器采集荧光信号，并依此确定DNA碱基的排列顺序。
DNA测序自动化和大规模测序的特点 原理同末端终止法 标记物为荧光染料 激光扫描自动测序 结果清晰、准确、分辨率高 测序速度快 200bp/h
Four color fluorescent dyes(BigDye)Mark end item 将荧光素连在4种ddNTP ddATP● ddTTP▲ddCTP◆ ddGTP★
DNA测序基本步骤（Basic steps in DNA sequencing） • 测序模板的纯化与定量 • 测序反应--PCR仪 • 测序反应产物纯化与变性 • 上样电泳--测序仪 • 分析结果
