Microbiology and Medical Parasitology Laboratory Practices

1. CLASE PRACTICA • Uso adecuado del Laboratorio de Microbiología y Parasitología Médicas como recurso de apoyo al diagnóstico y tratamiento de enfermedades infecciosas y parasitarias. • El cultivo de los microorganismos: clasificación de los medios de cultivo, métodos de siembra. Aislamiento en cultivo puro. Colonia. Medio selectivo y medio diferencial. Técnicas para el cultivo de aerobios estrictos. • Crecimiento bacteriano, la curva de crecimiento y sus fases. • Recolección, conservación y transporte de las muestras para estudio microbiano y parasitario. Condiciones generales. • Métodos para medir la actividad antimicrobiana “in vitro”. Métodos de difusión y dilución. Factores que afectan la actividad antimicrobiana “in vitro”.

2. Ante la presencia de una enfermedad infecciosa, el laboratorio puede contribuir a establecer su diagnóstico mediante pruebas que podemos agrupar en cuatro categorías: 1. Demostración del agente en muestras de los productos patológicos del paciente. 2. Demostración de una respuesta significativa de anticuerpos en el paciente. 3. Demostración de sensibilidad cutánea significativa (evidencia de hipersensibilidad a los antígenos de un agente infeccioso). 4. Demostración de alteraciones en determinaciones del laboratorio clínico.

3. De estas pruebas, al Laboratorio de Microbiología le competen las siguientes: 1. El diagnóstico del agente causal por medio de la visualización, el aislamiento y la identificación del agente. 2. La demostración de alguno de los antígenos del microorganismo. 3. La detección de genes específicos del agente en muestras del paciente mediante hibridación de ADN con ADN o de ADN con ARN. 4. La demostración de respuesta inmunitaria. 5. Las pruebas de laboratorio para contribuir con la selección racional del tratamiento antimicrobiano.

4. Con el uso adecuado del recurso microbiológico podemos lograr: 1. El diagnóstico y la orientación para el correcto tratamiento de pacientes individuales. 2. Vigilancia microbiológica a: a) Poblaciones abiertas: los datos microbiológicos figuran entre los primeros que sugieren la existencia de enfermedades epidémicas en la comunidad. b) Poblaciones cerradas: un número poco común de ejemplares de un solo patógeno o un cuadro poco común de susceptibilidad a los antimicrobianos puede indicar un brote de infección nosocomial. c) Pacientes en riesgo: predicción de aparición de infección nosocomial (prevenibles e inevitables).

5. Recolección, transporte de las muestras para estudio microbiano y parasitario. conservación y

6. Requisitos Generales • Obtenerla en cantidad suficiente. • Que sea representativa del proceso infeccioso. • Obtenerla en condiciones asépticas. • Garantizar traslado y procesamiento rápido. • Tomarla preferentemente antes de aplicar tratamiento antimicrobiano. • Características adecuadas de los recipientes (etiquetados, cerrados y esterilizados)

7. Requisitos Generales • La muestra constituye el elemento primordial para el éxito en el diagnóstico microbiológico. • Su obtención correcta de forma aséptica, en cantidad suficiente y conservación adecuada hasta el momento de la siembra, determinan el crecimiento y multiplicación de los MO. básicos: Cantidad, Calidad y • Principios Representatividad.

8. Tabla 1.- Muestras clínicas recomendadas para el diagnósitico microbiológico de las infecciones más comunes Tipo de infección Bacteriemia Infecciones cardiovasculares y asociadas a dispositivos intravasculares (IV) Endocarditis Hemocultivos/Válvula/Verrugas Infección del catéter Catéter IV, piel pericatéter, conexión del catéter Pericarditis Líquido pericárdico Sistema nervioso central Meningitis LCR Abscesos cerebrales Aspirados de abscesos Tracto respiratorio Faringoamigdalitis Exudado faríngeo Sinusitis Aspirado sinusal Otitis media Timpanocentesis Muestra Hemocultivos Comentarios No válidos los exudados nasales Otitis externa Neumonia Exudado oído externo Esputo, muestras obtenidas por fibrobroncoscopia, punción transtorácica aspirativa, punción transtraqueal, broncoaspirado Empiema y abscesos pulmonares Líquido pleural, aspirados de abscesos Nasofaríngeo Nasal Diagnóstico tosferina/Infecc. víricas Detección de S. aureus

9. Infecciones oculares Conjuntivitis Queratitis Endoftalmitis Infecciones gastrointestinales Diarrea Exudado conjuntival/raspado Raspado corneal Líquido intraocular Heces/Biopsia intestinal/ Aspirado duodenal Infecciones intraabdominales Peritonitis Líquido peritoneal Aspirados de abscesos Abscesos intraperitoneales y abscesos viscerales Colecistitis Tracto urinario Infección urinaria Líquido biliar Orina (micción media, sonda) Orina obtenida mediante punción suprapúbica Diagnóstico de bacteriuria por anaerobios y de ITU en niños Tracto genital Úlceras genitales Nódulos genitales Uretritis Vulvovaginitis Raspado de la úlcera Aspirado del nódulo Exudado uretral Exudado vaginal Detección de S.agalactiae (también exudado rectal ) Acompañada de orina pre y post masaje prostático Cervicitis Prostatitis Exudado endocervical Secreción prostática Piel y tejidos blandos Impétigo, foliculitis, erisipela, celulitis, úlceras, infecciones gangrenosas, abscesos cutáneos, heridas y quemaduras Preferiblemente aspirados tomados con jeringa y biopsias de tejido. Son menos recomendables las muestras tomadas con torundas

10. Pruebas de susceptibilidad a los antimicrobianos Tan pronto como fue introducido en la práctica clínica el uso de los antibióticos, surgió asimismo la necesidad de crear métodos de laboratorio capaces de medir el grado de efectividad de los agentes antimicrobianos. La variedad de métodos y pruebas especiales destinadas al estudio de la susceptibilidad son muy variados y con el tiempo se han ido perfeccionando con el propósito de hacerlos más eficientes y efectivos

11. Las antimicrobianos se conocen con el nombre genérico de ANTIBIOGRAMA. pruebas que miden la susceptibilidad a los Un Antibiograma consiste en... Enfrentar un microorganismo a una concentración conocida de una droga antimicrobiana para evaluar su efecto midiendo el crecimiento microbiano a una temperatura y tiempos dados y comparándolos con un estándar de referencia

12. Todos los métodos de laboratorio conocidos se basan en diluir o hacer difundir el antibiótico que se va evaluar en un medio de cultivo específico donde posteriormente se cultiva el microorganismo de prueba. Algunos métodos combinan ambos principios (difusión y dilución) como el E-test. Otros, son métodos automatizados de fundamento variable en dependencia del sistema empleado. En todos los casos los resultados se interpretan a través de las denominadas categorías de susceptibilidad.

13. Las categorías de susceptibilidad son... SUSCEPTIBLE: (S) Significa que el microorganismo causante del proceso infeccioso debe responder exitosamente al tratamiento con ese antibiótico a las dosis habituales recomendadas y por una vía apropiada.

14. MEDIANAMENTE SUSCEPTIBLE O INTERMEDIO: (MS o I) Significa que el microorganismo solo se inhibirá por la droga, si ésta se aplica en una dosis máxima y utilizando una vía parenteral. Salvo seleccionarse para el tratamiento, sobre todo aquellos casos en los que la dosis terapéutica está muy cercana a los rangos de toxicidad. excepciones, estos medicamentos no deben

15. RESISTENTE: (R) Significa que el microorganismo no se inhibirá a las concentraciones séricas habitualmente alcanzadas por la droga cuando ésta se administra a la dosis recomendadas. y por la vía

16. Es importante que tengas en cuenta... Que los resultados que se obtienen en el laboratorio a través susceptibilidad por cualquiera de los métodos que se emplee, lejos de ser un resultado frío cualitativo y/o cuantitativo, constituye el fiel reflejo de los procesos moleculares que se producen en la célula. de una prueba de

17. Los métodos de susceptibilidad... El Método de macrodilución en caldo:  Fue el primero que se diseñó y constituye el método de referencia.  Se realiza en tubos que contienen un caldo de cultivo apropiado (Caldo de Mueller-Hinton).  En ellos se realizan diluciones sucesivas del antibiótico partiendo de una concentración conocida del mismo  Luego, los tubos se inoculan con igual cantidad de inóculo del microorganismo de prueba y se incuban durante 18 – 24 horas a 37oC, tiempo al cabo del cual se realiza la lectura.

18. Lectura: Se realiza a simple vista, identificando el tubo con la menor concentración del antibiótico en la cual hay total ausencia de turbidez indicadora de no crecimiento bacteriano. Observa la siguiente imagen: De derecha a izquierda: el tubo número 3 sería en la identificado menor concentración en la cual no existe crecimiento microbiano visible. serie con el la

19. La menor concentración del antibiótico identificada en la cual no se observa crecimiento microbiano, se conoce como la concentración mínima inhibidora y se identifica por las siglas CMI que se expresa en µg/ml. Vuelve a observar la imagen anterior... Supón que en este ejemplo se partió de una concentración del antibiótico equivalente a 128 µg/ml (primer tubo de la serie de derecha a izquierda) En el tubo 2 habría una concentración de 64 µg/ml y el tubo 3 tendría entonces una concentración de 32 µ/ml. Esta sería en este caso la CMI para ese antibiótico.

20. Este resultado se compara con estándares de referencia creados al efecto internacionalmente por el que se determina entonces, que categoría de susceptibilidad se corresponde con esta concentración para ese antibiótico en específico. Informe del Laboratorio... El laboratorio informará el nombre del antibiótico y a continuación el valor de la CMI obtenido seguido entre paréntesis de la categoría de susceptibilidad correspondiente. Ejemplo: Penicilina: 32 µg/ml (R)

21. Ventajas del método: Bastante exacto Desventajas: Gran complejidad de realización y elevado costo Método de microdilución en caldo: Es el mismo método llevado a microténica. Se realiza en placas de microtitulación de fondo plano. Tiene como ventajas que emplea una pequeña cantidad de recursos y mayor factibilidad de realización. Se considera el ideal para monitorear el tratamiento antimicrobiano en el paciente grave. Muchos métodos automatizados tienen actualmente como base esta variante.

22. Método de difusión de Bauer-Kirby: Es el internacionalmente recomendado para la práctica hospitalaria de rutina por su gran sencillez y bajo costo, aunque es necesario señalar que puede estar sujeto a múltiples errores técnicos por lo que debe ser seguido a través de un exhaustivo control de la calidad.  Se realiza en placas de cultivo conteniendo Agar de Mueller- Hinton sobre las que se extiende el microorganismo de prueba con un hisopo de algodón estéril.  Sobre la placa inoculada se colocan, ayudados por una pinza y bajo condiciones estériles, pequeños discos de papel de filtro preparados comercialmente que contienen cantidades específicas de cada antibiótico.  Las placas se incuban por 18-24 horas tiempo al cabo del cual se realiza la lectura.

23. Observa el siguiente diagrama... Aquí de una forma muy simple se esquematizan los pasos de que montaje de un antibiograma por el método de difusión de Bauer-Kirby, precisamente en honor a sus diseñdores. consta el llamado así Al posteriormente la lectura... concluir este paso se realiza la incubación y

24. LECTURA: El antibiótico impregnado en el disco, al hacer contacto con la superficie húmeda de la placa difunde en el medio impidiendo el crecimiento del microorganismo de prueba. En correspondencia con el grado de susceptibilidad, como resultado se producirá un halo de transparencia (halo de inhibición del crecimiento) alrededor de cada disco de antibiótico.

25. Observa detenidamente la siguiente imagen... Aquí puedes apreciar los halos de alrededor de cada disco. inhibición Observa como cada uno puede tener un diámetro diferente o sencillamente no poseer prácticamente ninguno.

26. En este momento se procederá a medir con una regla plana el diámetro de cada uno de estos halos en milímetros. Cada resultado se anotará para luego compararlo con los datos de las tablas con los valores de referencia creados al efecto para así determinar las categorías de susceptibilidad. El laboratorio informará... El nombre del antibiótico y seguidamente la categoría de suceptibilidad correspondiente. Ejemplo: Penicilina: R

27. Problema: “Usted tendrá en su puesto de trabajo los resultados de un antibiograma realizado por el método de difusión de Bauer-Kirby y otro realizado por uno de los métodos de dilución. Deberá determinar la categoría de susceptibilidad correspondiente en cada caso e interpretar los resultados”. Procedimiento: Antibiograma por el método de Bauer-Kirby:  Compare cada uno de los valores que se le ofrecen con los datos que aparecen en la Tabla 1 y determine la categoría de susceptibilidad correspondiente a cada antibiótico.  Describa en su cuaderno como se informarían y como usted interpretaría estos resultados desde el punto de vista clínico.

28. Antibiograma por el método de dilución:  Compare los valores de CMI que se le ofrecen en el problema con los datos de la Tabla de referencia (Tabla 2)  Determine las categorías de susceptibilidad en cada caso  Informe e interprete estos resultados desde el punto de vista clínico. Datos del antibiograma por el método de difusión: Agente causal: Proteus mirabilis Antibiótico Lectura en milímetros • Ampicilina 12 • Gentamicina 17 • Tetraciclina 24 • Ciprofloxacina 15

29. Tabla 1. Referencia para determinar las categorías de susceptibilidad por métodos de difusion. Tamaño del diámetro (mm) R I S Antibiótico Contenido del disco (µg) 10 30 30 10  13 14 – 16  17  14 15 – 17  18  13 14 – 20  21  12 13 – 14  15 Ampicilina Cefazolina Ceftriaxone Gentamicina  14 15 – 18  19  15 16 – 20  21  12 13 - 17  18  12 13 – 15  16 Tetraciclina Ciprofloxacina Cloramfenicol Fosfomicina 30 5 30 200

30. Resultados del antibiograma por el método de dilución: Agente causal: Escherichia coli Antibiótico CMI obtenida en µg/ml •Cefazolina 64 • Kanamicina 2 • Ciprofloxacina 16 • Gentamicina 0,5

31. Tabla 2. Referencia para la determinación de las categorías de susceptibilidad por método de dilución CMI (µg/ml) Antibiótico R I S  8  32 Ampicilina 16  32  8 Cefazolina 16  32  16 Kanamicina -  8  4 Gentamicina -  4  1 Ciprofloxacina 2

32. Como debes presentar tus resultados... Elabora un informe con los resultados obtenidos donde destaques los siguientes aspectos:  Antibióticos susceptibles, intermedios y resistentes  Elabora interpretarías desde el punto de vista clínico y cuales antibióticos serían los más factibles de ser utilizados para el tratamiento. un comentario basado en como los

33. CURVA DE PROLIFERACIÓN

36. Finalmente, el agotamiento de nutrientes o la acumulación de completo. Sin embargo, en la mayor parte de los casos, duranteesta etapa se lleva a cabo un recambio celular: se pierden lentamente células que mueren pero esto se contrarresta por la formación de células nuevas a través de desarrollo y división. Cuando esto ocurre, la cuenta celular total aumenta lentamente aunque la cuenta viable permanece constante.