实验五酶联免疫吸附试验（ ELISA ）

实验五酶联免疫吸附试验（ELISA）

一、目的 • 掌握ELISA的操作方法 • 了解ELISA在动物疫病诊断的意义

二、材料 • 酶标条、猪链球菌9型抗原、待测血清、阴性血清、碳酸盐缓冲液、洗涤液、封闭液、底物缓冲液、加样器等

酶联免疫吸附试验ELISA （enzyme linked immunosorbent assay）是一类常用的免疫酶技术。是将已知的抗原或抗体吸附在固相载体表面，使抗原抗体反应在固相表面进行。常用的酶：辣根过氧化物酶(HRP) 碱性磷酸酶（AP）。

ELISA检测抗体 Ag + Ab1 ↔ Ag-Ab1 Ag-Ab1 + Ab2* ↔ Ag-Ab1-Ab2*

ELISA检测抗体 Ab + Ag* ↔ Ab-Ag*

ELISA检测抗原 Ag + Ab* ↔ Ag-Ab*

三、操作步骤 • 包被抗原抗原用包被液稀释至合适浓度，加入到酶标板中，100μl/孔，放入湿盒中，4℃过夜或37 ℃ 2h，洗涤液（PBST）洗涤1遍 (200μl/孔)，泡洗3min，甩干孔中液体洗涤液（PBST）：PBS 1L，Tween-20 0.5ml，调PH 至7.4 包被用缓冲液 • pH9.6碳酸盐缓冲液 (Na2CO3 1.5g，KCl 0.2g，NaHCO32.9g，加双蒸水至1L ) • pH7.2的磷酸盐缓冲液

包被蛋白用PBS稀释至浓度范围1μg/ml-50μg/ml(可溶性抗原浓度通常在1-10μg/ml)，可设不同抗体稀释度来确定最佳使用量包被蛋白用PBS稀释至浓度范围1μg/ml-50μg/ml(可溶性抗原浓度通常在1-10μg/ml)，可设不同抗体稀释度来确定最佳使用量 • 如果包被的是细菌，则选择OD600为0.6左右，用包被液洗涤两次，超声裂解（工作5s，间隔10s，总共80次），之后可进行包被

封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附封闭就是让大量不相关的蛋白质充填这些空隙，从而排斥ELISA后的步骤中干扰物质的再吸附 • 封闭液（含2%BSA的PBST）,200μl/孔，37℃，2h后弃去封闭液，经PBST洗涤一次拍干后可现用，也可在－20℃保存2－3个月

加入一抗 • 加入待测样品：血清样品1：100开始倍比稀释，加入酶标反应孔中，每样品加双孔，每孔100微升， 37℃孵育1h ，PBST洗三遍（每孔200微升），每次3min，拍干；

加入二抗 • 加入特定的抗抗体 • 二抗的稀释倍数根据需要有不同：一般1：5000-10000， 37℃孵育1h ，PBST洗三遍（每孔200微升），每次3min，拍干；

显色 HRP的两种底物： • OPD氧化后的产物呈橙红色，用酸终止酶反应后，在492nm处有最高吸收峰，灵敏度高，比色方便，是HRP结合物最常用的底物 • TMB经HRP作用后共产物显蓝色。TMB性质较稳定。最适吸收波长为450nm。

AP的底物： • 磷酸酯酶，一般采用对硝基苯磷酸酯作为底物。 • 产物为黄色的对硝基酚，在405nm波长处有吸收峰。

酶反应终止液 • 常用的HRP反应终止液为2mol/L硫酸 • AP的终止液用NaOH

结果判定 • 加入底物液（TMB）：每孔加入100微升，室温下放置10 min • 终止反应：每孔加入终止液 50微升 • 测定OD450：终止反应后30分钟内用酶标仪测定450nm波长的光密度值 • 结果判定：用测定样品孔的吸收值与阴性标本测定孔平均吸收值的比值（P/N）表示，当P/N大于2.1时，判定为阳性

洗涤洗涤在ELISA过程中虽不是一个反应步骤，但却也决定着实验的成败。 ELSIA洗涤：达到分离游离的和结合的酶标记物的目的。清除残留在板孔中游离的物质，以及非特异性地吸附的干扰物质。聚苯乙烯等塑料对蛋白质的吸附是普遍性的，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。可以说在ELISA操作中，洗涤是最主要的关键技术。洗涤的方式除某些ELISA仪器配有特殊的自动洗涤仪外，手工操作有流水冲洗式和浸泡式两种：

作业 • 实验报告 • ELISA的原理 • ELISA的意义

实验五酶联免疫吸附试验（ ELISA ）