Iltmangel i Regnbueørred Genomics, proteomics og cellesignalering

1. FIBP: Fish Physiology, Biochemistry and Food Iltmangel i RegnbueørredGenomics, proteomics og cellesignalering

2. De involverede personer Vores samarbejdspartnere: • Docent Else Kay Hoffmann, Ph.D. (Institut for Molekylærbiologi, KU) • Senior forsker Flemming Jessen, Ph.D. (Afd. for Fiskeindustriel Forskning, DFU, DTU) • Ph. D.-stipendiat Tune Wulff, cand. scient. (Institut for Molekylærbiologi) • Post doc. Carlo G. Ossum, Ph.D. (Institut for Molekylærbiologi) University of Waterloo, Ontario, Canada: • Professor Niels C. Bols, Ph.D. • Professor Mathilakath M. Vijayan, Ph.D. University of Liverpool, Liverpool, UK: • Professor Andrew Cossins , Ph.D. Syddansk Universitet, Odense: • Professor Peter Roepstorff , Ph.D.

3. RTHDF cellelinien RTHDF – rainbow trout hypodermal fibroblasts – blev isoleret fra muskeloverfladen og kan således forventes at indgå i den spiselige del af fisken. Cellelinien opstod uden manipulation af de primære celler. (Ossum et al., 2004) Så vidt vi ved, er dette den første cellelinie fra spiseligt væv hos laksefisk.

4. Vores modelsystemer • Cellerne oplever en ilt-mangel lignende situation når vi behandler dem med stoffet natrium azid (NaN3) og egentlig iltmangel når vi behandler med kvælstof (N2). • NaN3 blokerer cellernes mulighed for at producere tilstrækkelige mængder ATP – cellernes energibærer. Det samme sker under iltmangel. • Fjernelse af NaN3 og N2 lader cellerne omsætte ilt og producere ATP igen. • Vores eksperimenter retter sig mod de biokemiske begivenheder, der følger iltmangel og efterfølgende geniltning.

5. Vores strategier • Vi studerer ændringer i udtryk af gener (genomics). • Vi studerer ændringer i udtrykte proteiner (proteomics). • Vi studerer de vigtigste signalveje i cellerne som påvirkes af iltmangel (cellesignalering).

6. En scannet microarray slide Gul:ingen regulering Grøn: opreguleret Rød:nedreguleret Hvid: skyldes mætning • Ved scanning skal arrayet virke gult • Her vises et udsnit.

7. GTAC GTAC CATG CATG Detektion ved hjælp af hybridisering CATG Plade med ca 22.000 kendte gener probes med cDNA fra kontrollceller og eksperimentelt behandlede celler, der er farvet hhv grønt og rødt. Ratioen mellom grøn og rød farvning kan bestemmes og dermed give en kvantificering af genudtrykket.

8. Hvilke typer gener bliver ændret efter iltmangel

9. Proteomanalyse • 2-dimensional gel-elektroforese • Farvning af proteinerne • Scanning af gelerne • Billedbehandling Sikre sammenligning af de rigtige proteiner Måler mængden af de enkelte proteiner • Massespektrometri Identificerer de enkelte proteiner

10. Flowchart af proteomeanalyse 1.D: Ladnings adskillelse/isoelektriskfokusering 4,0 pH 7,0 Proteinekstraktion MW Sølvfavning viser alle proteiner i 2D gelen pH 2.D: Størrelses adskillelse/SDS-PAGE Pletter fra 2D gelen udskæres og proteinet identificeres ved massespektrometri

11. 2-dimensional gel pI 4 7 120 Mw Mere end 1500 forskellige pletter 12

12. Hvilke typer proteiner bliver ændret efter iltmangel

13. Cellulær signalleringOverlevelses og stress signaler • ERK – extracellular regulated protein kinase – er et signalprotein, der stimulerer cellernes vækst og delingsprocesser. ERK er derfor et overlevelsesprotein. • p38 er et stress-aktiveret signalprotein, der er vigtig for at tilpasse sig et stressfyldt miljø, og den er involveret i celledød. p38 er derfor et stress-protein. • Hsp70 – heat shock protein 70 – er et beskyttelsesprotein, der produceres som en reaktion mod skadeligt stress. Vi kan se på Hsp70 som en slags cellulær vicevært.

14. Hvorfor studere disse proteiner? • ERK og p38 tilhører en gruppe signalproteiner, hvis aktivitet set i forhold til hinanden, er afgørende for cellernes liv og død. • Hsp70 kan reparere skadede proteiner eller sende dem til nedbrydning. Hsp70 medvirker også til hæmming af programmeret celledød.

15. Metoder brugt her:SDS-PAGE & Western blotting Overføring til nitrocellulose, vha elektroblotting. Dvs at sætte strøm 90 på gelen. SDS-polyacrylamid elektroforese Forsøg og ekstraktion af protein +++++++++ MW • - - - - - - - - Kvantificering og databehandling. Fremkalding af resultat

16. ERK og p38 Ilt- mangel ERK p38 Stimulering af vækst og celledeling Vækst hæmning. Celledød Funktioner Cellekernen

17. Phospho-p38 Anoxia Phospho- p44ERK 5 10 30 (min) 50 kDa 40 kDa Anoxia (min) 5 10 30 ERK hæmmes og p38 aktiveres af kemisk iltmangel Der er anvedt antistoffer, der genkender de fosforylerede proteiner. Fosforylering af disse proteiner, indikerer aktivering.

18. Normoxia + SB203580 Anoxia + SB203580 Normoxia Anoxia 50 kDa Phospho- p44ERK * 40 kDa p38 hæmmer ERK SB203580 er en kemisk hæmmer, der er specifik for p38.

19. 50 kDa 40 kDa Phospho- p44ERK Normoxia + RKI Anoxia + RKI A/R + RKI Normoxia Anoxia A/R 50 kDa Phospho- p44ERK 40 kDa Geniltning aktiverer ERK uafhængigt af den normale aktiveringsvej for ERK, som går over proteinet Raf Recovery Anoxia 5 10 30 60 (min) RKI = Raf kinase inhibitor; en specifik kemisk hæmmer af proteinet Raf.

20. Serum, Normal ilt Kemisk iltmangel Geniltning Ras Ras RPTK Src O2 O2 NAD(P)H oxidase P P P P Raf Raf PKC MEKK1 ROS p38MAPK MEK MEK MEK ERK ERK ERK Grb2 SOS Model for cellesignaleringen under iltmangel og geniltning af fiskecellerne

21. ADP Hip ADP ATP ATP ADP Proteinet Hsp70 – cellulær vicevært Foldet protein Denatureret protein Stress Hsp70 Hip K+ Hsp40 Pi Destruktion ATP Bag/Hop ADP Semi-foldet protein Reparerer beskadigede proteiner eller sender dem til destruktion

22. Heat shock, 28°C Kontrol, 21°C 0 5 min 10 min 30 min A B Hsp70 Hsp70 Tidsafhængig ekspression af Hsp70 under iltmangel Hvis RTHDF celler udsættes for kemisk anoxi i 30 minutter udtrykkes Hsp70. Vores undersøgelse (Ossum et al., 2004) er den første der viser Hsp70-expression efter iltmangel i fiskeceller.

23. Primer DNA polymerase Primer Syntetiseret DNA 5’ 5’ 3’ 3’ DNA polymerase Q F Primer 5’ 3’ Metode: Real-time PCR PCR – Polymerase chain reaction – er en metode for opformering af en specifik DNA sekvens. PCR sker ved brug af primere, der definerer den ønskede DNA sekvens og en DNA polymerase: Ved real-time PCR anvender man en probe med en fluorofor (F) og en quencher (Q). DNA polymerasen vil frigive fluoroforen og da kan vi måle lys-signalet og anvende dette til kvantificering af et specifikt genudtryk.

24. hsp70 mRNA geniltning bliver udtrykt ved geniltning Kemisk iltmangel Egnentlig iltmangel Genlitning efter egentlig anoxi fører til en aktivering af hsp70a genet efter 1 time og bliver ved over tid. Genlitning efter kemisk anoxi medfører en transient aktivering af hsp70a genet.

25. Konklusioner Under iltmangel sker der ændringer i cellen som foregår på mange niveauer: • Ændringer i aflæsningen af en lang række gener. • Ændringer i hvilke proteiner, der findes i cellen. • Ændringer i signaloverførsel i cellen.

26. Publikationer • Carlo G. Ossum, Else K. Hoffmann, Mathilakath M. Vijayan, Shawn E. Holt & Niels C. Bols (2004). Characterization of a novel fibroblast-like cell line from rainbow trout and responses to sublethal anoxia. Journal of Fish Biology 64; 1103-1116 • Carlo G. Ossum, Tune Wulff & Else K. Hoffmann (2006). Regulation of the mitogen-activated protein kinase p44 ERK activity during anoxia/recovery in rainbow trout hypodermal fibroblasts. Journal of Experimental Biology 209; 1765-1776 • Tune Wulff, Else K. Hoffmann, Peter Roepstorff & Flemming Jessen. Comparison of two anoxia models in rainbow trout cells by a two-dimensional gel electrophoresis and MS/MS based proteome approach.Submitted to Molecular and Cellular proteomics. • Tune Wulff, Flemming Jessen, Peter Roepstorff & Else K. Hoffmann. Long term anoxia in rainbow trout investigated by 2-DE and MS/MS.Submitted to Proteomics E-mail: cgossum@aki.ku.dk