1 / 53

A. PENDAHULUAN DEFINI SI

ELEKTROFORESIS. A. PENDAHULUAN DEFINI SI Migrasi dari solut yang bermuatan dalam media cair/padat dan berada dalam medan listrik Banyak senyawa dalam bentuk molekul yang mudah terionkan seperti amino acids, proteins, nucleotides, nucleic acids

belden
Download Presentation

A. PENDAHULUAN DEFINI SI

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript


  1. ELEKTROFORESIS A. PENDAHULUAN • DEFINISI • Migrasi dari solut yang bermuatan dalam media cair/padat dan berada dalam medan listrik • Banyak senyawa dalam bentuk molekul yang mudah terionkan seperti amino acids, proteins, nucleotides, nucleic acids • Senyawa (partikel) bermuatan dalam medan listrik yang bermuatan nigatif (-) bergerak ke anode (+), yang bermuatan (+) akan bergerak katode (-)

  2. 2.KEGUNAAN Elektroforesis untuk pemisahan campuran senyawa yang berbeda dengan teknik analisis serta pemisahan yang pernah didiskusikan. • Pemisahan tergantung pada ; • 1) Struktur kimia • 2). pH, • 3). Gugus fungsional • 4).Dan bobot molekulnya. • Analisis ini sangat informatif tentang data: • 1).Senyawa metabolit maupun senyawa biokimiadengan BM besar . • 2) Tidak diperlukan jumlah besar, dan pemurnianyang tinggi. • 3). Dapat digunakan sampel langsung tanpa pemisahan, misalnya urin dan cairan limpa.

  3. Agarose Gel Electrophoresis System

  4. Kegunaan lanjut • 4). Senyawa yang bersifatpolar, bermuatan ataubersifat zwitter ion • Elektroforesis sangat bermanfaat untuk mengetahui : • a). Nasib dari obat yang diberikan kepada pasienatau binatang percobaan. • b). Dengan analisis elektroforesis perjalanan obatdapat dilacak • c).Alat yang menggunakan tenaga 100 volt/cmsecara bertingkat, dapat memisahkan beberapasenyawa hanyadalam 15menit. • d). pemisahan tersebut dilakukan dengan mengaturpH yang berkisar antara 2 sampai dengan 12. • e).Untukanalisiskualitatif,maupunkuantitatif asal ada detektor (densito meter)

  5. 3. METODOLOGI • Dikemukakan olehTelliuspadapemakaianpertama kali sekitartahun 1930, untukmemisahkan protein dalamlarutandapar yang ditempatkandalamtabungberbentuk u. • Pada keduaujungdiberikanelektrodenegatifdanpositif yang kemudiandiberiarussearah. Denganpengaruhmedanlistriktersebut, protein akanbergeraksecarabebasmenujukutupyang belawanandenganmuatannya. • Gerakantersebutgaris (baundery), sehinggadisebutmoving baundery, karenaterjadinyaperistiwaitudalamlarutandinamakanfree solution. Gerakan tersebut dipengaruhi pula oleh bobot jenismolekul yang tentusajasesuaidenganbobotmolekul.

  6. Metode yang lain disebutzon electrophoresis • Sampelditotolkanpadalapisandatarataukertas yang basahdenganlarutandapar, kemudiankeduaujungkertasdiberiaruslistriksearah, dengantegangantinggi. • Karenapengaruhmedanlistrikmakaterjadigerakanbercakkearahelektrodepositifmaupunnegatif (Lehninger, 1988 danConway 1977). • MenurutBio-rad (1983), berdasarperalatan danteknikpengembanaganalatelektroforesisdibedakanmenjadislab electrophoresisialahmenggunakanlempengsebagaifasediam, • Dan tub electrophoresismenggunakanbahanfasediam yang ditaruhdalamtabung. kemudiankarenaterjadigerakanmendatardanvertlkaldibedakanmenjadielektroforesis vertical danhorizontal.

  7. B. TEORI ELEKTROFORESIS • 1. LARUTANBEBAS • Elektroforesis dalam larutan bebas atau moving bounderyelectrophoresis, migrasi ion mempunyaikecepatandasar yang, dirumuskan: • Vo= Adalah kecepatan migrasi dalam larutan yangpaling encer dalam medan listrik X.= Besarnya medanlistrik dirumuskan : • E dalam satuan volt, f = panjang larutan dalam stuan cm, dan Uo dalam cm/detik. maka Vo dalam satuan cm2, detik-1 volt1. Karena itu persamaan elektroforesis menjadi : Uo = Vo/X (1) X =E/f 1(2) Q Uo = ———(3) Ar2

  8. Uoadalahmobiltas ion dalamlarutan, Q = muatanpartlkel, r radius efektifpartlkel, = viskositas • Medium. HargaQ dapatdiganti denganZdanE, yang masing-masing valensi dan jumlah elektron • Para pengaranguntukmenuliskanmobilitaspartikelpadaelektroforesiskertassebagaiberikut: ZE Uo=——— (4) Ar2 Q Uo= —————(5) Ar2

  9. Fx = QX (6) • :Bila kekuatan medan X maka kekuatan dalam sistemmenjadi Fx, yang dirumuskan Fx menyatakan kecepatan total maka menurut 1.HUKUM STOCKES: • dengan menggabungkan rumus 7 dan 6 dan berdasarpersamaan pertama (1): kenyataan hukum stockes hanya efektif untuk ukuran partikel 1300 Ao dan tidak berlakuuntukmolekulmendekati ukuran molekul air. Fx = 6 rVo (7) Q Uo=————(8) 6 r

  10. Biladicobapadaamoniumkuaternerdandibuatgarisregresihubungan log mobilitaspadakonduktivitastertentu; dengan log radius ion, didapatkan slope -2,33. • MenurutpenelitianEdwarddanWaldronuntukion-ion organik yang beradius 3-5 A0sebaiknyamenggunakanrumus: • Jelas sekali bahwamobilitaspartlkelsangattergantung pada radius, valensi dan jumlah muatan,dankekentalan medium. • Untuksenyawa yang bersifatzwitter ion dipengaruhi besaranf/fo, menyatakanrasio radius yang berbentukelips. ZE Uo =————(9) 5rw(f/fO)

  11. 2. PENGARUH KADAR ELEKTROLIT • Berbagai laporan yang dikumpulkan oleh Conway (1977), partikel yang mempunyai ukuran sebesar 2,30Ao (etilamonium) sampai dengan naftilkarboksilat (3,61A0), mempunyai garis linier yang baik sesuai dengan rumus (9). • Mac. Donald dkk, hasil percobaannya menggunakan medium air suatu senyawa pada suhu 250 c, mempunyai harga mobilitas yang besarnya dinyatakan sebagai: • Merupakan kekuatan ion, ini berarti merupa- kan besarnya konduktivitas(daya hantar listrik) suatu larutan. • Konduktivitas larutan anorganik 0,1m ber pengaruh pada mobilitas ion organik dengan penurunan sebesar 8%, U = Uo -(3,124 X 10-4 + 0,2605 Uo (10) = 1/2CIZI2 (11)

  12. Pengaruh Kadar ion Medium • Bilakadar ion dinaikandari0 menjadi0,01m. Mengalamipenurunansampai 20 % • Bilakadar ion dinaikkandari 0 menjadi 0,1 m. Untukmobilitasion divalenakanmengalamipenurunansampai 36%, • Medium elektroforesisumumnya, kertas, bubukgelas, ataububuk yang lain, silica gel, seluloseasetat yang umumnyamenghasilkanmuatannegatifpermukaan, • Sedangkanbagianbawahpermukaanbermuatanpositif,makaakanbergerakkearahkatode. • Hasilny a adalahsemuadaerah (bercak), termasukbahannetralakanikutbergerakterbawaolehproseseletroosmotiktadi. • Besarnyaelektroforesissangatbervariasitergantungpadasifatalamidaribahansupportnya, pHeletrolit, sehinggadapatdiukurjarakmigrasinya. (Gambarberikut).

  13. Migrasi sampel dan osmose

  14. Eletroosmosis 2.Eletroosmosisdanmobilitasrelatif Bilaelektoforesissedangdalamprosesdan • Teganganlistrikdiberikan, makaterlihatadanyamigrasipartikel ion, baik itudalamlarutanmaupunpadalempengataukertas yang digunakansebagai media • Gerakantersebutdinamakanaruselektoosmotikatauefekelektroosmotik. Efektersebutcukupbesarbilaselatau media elektroforesismempunyaibentukpaking yang porussertaberadabersamaelektrolit. • Larutanatau media akanmenyesuaikan, danbahkandapatmembentukmuatan • Larutan pun akanmengalamigerakankearah

  15. Elektrode yang muatannyaberlawanan • Elektrode yang muatannyaberlawanan. • Mobilitassenyawabakuadalah (MA,) danmobilitassenyawa yang diujiadalahMB, kemudianjaraktempuh (migrasi) masing- masingsenyawa adalah a dan b. • (Jarakdinyatakandalamcm, dan t waktudalamdetik).Karenaitumigrasirelatifsebenarnyaadalah MB/MA = B/A. Cara demikianhanyauntukpembedaansaja, • Dalampenggunaanbiasany a langsungdiukurmasing- masingjarakmigrasisampel yang diujidibandingkansenyawabaku. Harga MA = a/t; dan MB =b/t.

  16. 4. EFEK DARI KERAPATAN MEDIUM • Telah diketahui bahwa porositas akan menurunkan kecepatan mobilitas ion, faktor yang berpengaruh adalah: • a). Kelurusan porus atau torturosity • b). Kontruksi dari media (homogenitas) • Ion dapat mengalami retardasi (penahanan) karena pengaruh elektrolit dan muatannya. Karena elektrolit berada dalam keadaan statis dalam porus media. Bahkan diadsorbsi oleh media atau suportnya. d a a= jarak migrasi dapar b= jarak migrasi sampel d= jarak letak sampel dan dapar awal b

  17. Untuk menguji tingkat adsorbsi menurut Edward dan Waldon, dibiarkan larut an dapar bergerak kearah tertentu, pada kertas kromatografi. • Ditotolkan bercak pada jarak (10 cm), dibelakang larutan dapar, diberi arus listrik searah, sampai bergerak sepanjang (13 cm), maka jarak yang ditempuh sampel (b), dan ternyata jaraknya lebih kecil dari jarak yang ditempuh oleh larutan dapar.(a). • Selisih jarak migrasi larutan dapar dengan sampel merupakan faktor adsobsi yang disimbulkan dengan ƒ.bilaa=; jarakmigrasidaparsetelahperlakuan, danb = jarakmigrasisampel,setelahperlakuanmakaharga. ƒ= b/ a. • Cara pengukurandiatas, hanyaberlakubilalarut an dapardianggaptidakmengalamiadsorbsi.

  18. Bilahargaƒ=1, dapatdiabalkan, hargainiterjadibilamolekul ion sangatkecilsebesarmolekul air. • Tetapiuntuksenyawa yang berupaaromatik, danheterosiklikhargafaktoradsorbsi < 1. Parameter yang digunakanadalahasampikratsebagalpembaku anion, danbutilamoniumsebagalpembakukation. Untukmenghitungmobilitasrelatifmrdigunakanrumus : • Rumustersebutdapatdigunakanuntukmenghitungmobilitasrelatif tetapi terda pat faktor berpengaruh pada mobili tas: • Sebagalcontohadalah pH, mobilitasrelatifbutilamoniumpada pH 1,5 kuranglebihdariperhitunganteoritis 5%, • Uo = 1,14 X 10-3 (Z/[rw(ƒ/ƒO)] (12) • DAN MR = f/(fsUs) (13)

  19. Sedangkan o-aminobenzoat hanya 1/3dari perhitungan. • Gugus karboksilat yang hanya terionisasi kecil pada pH rendah tidak terlihat adanya kenalkan atau penurunan mobilitas.. • Mobilitas asam pikrat pada pH 11,4 tidakdapat diperhitungkan dengan menggunakan cara koefisien difusi.Waldmann-Meyer (1963), menyajikan cara koreksi pada faktor adsorbsi. Untuk mendeteksi proses elektro-foresis. • Dekstran yang digunakan sebagal pembanding, yang tidak diserap oleh kertas kromatografi digunakan untuk mengetahui aliran elektroforesis (slide 13)

  20. 4. PENGARUH pH DAN pKA MIGRAN • Pada mobilitasdasar timbulnya efek ph dan pka tersebut terja dinya tingkat disosiasi pada asam atau basalemah yang dinyatakan dengan simbul persamaan ionisasi sebagai berikut: • Harga ka, adalah tetap, tetapi  (tetapan disosiasi) berubah yang tergantung pada ph, maka persamaan harga sebagai berikut: HBH++ B-, (14) [B-]  =————(15) [HB]+[B-] [H+][B-] Ka = ————(16) [HB]

  21. [HB], [H+] DAN [B-], Merupakan kadar ion atau konstitusi ion, hb merupakan senyawa netral tak terpe­ngaruh oleh medan listrik, maka hanya B- yang terpengaruh, sedangkan H+ karena kecil tidak terpengaruh. Persamaan 16, • Ka mempunyai harga tetap, dalam analisis dengan elektroforese • Adanya senyawa netral HB. Kecuali tujuan analisis untuk menghitung pengaruh pH terhadap derajat ionisasi. Karena itu senyawa harus berubah menjadi ion B- semua, maka diperlukan optimasi pH. • Analit dengan  rendah (sulit). pH perlu diubah- ubah agar bentuk ion B-menjadi maksimal.Perlu waktu agar proses disosiasi jadi sempurna. • Proses disosiasi tidak dibiarkan dalam alat akan timbul bentuk bercak yang berekor kuantifikasi. Sulit.

  22. pH = pKA + LOG (19 [B-]  U —— = —— = —— (20) [HB] 1-  u-U U Rumus 19 berlakuuntukasamlemahmonoprotik(bervalensi1), • Perbedaanmobilitasdinyatakan-u,hargainimerupakanjarakmigrasi yang diukur.Dirumuskanberikut yang eratdengan ph larutandapar: Rumus 21 dikembangkan, danbentukmobilitassesuaidenganperubahan pHdanperubahanionisasiasammonoprotikdenganprofilnyasbb: pH=pKa + LOG [u-U](21)

  23. Profil peruraian asam monoprotik • HA  H+ + A- • MOH M++ OH- • Bila asam lemah peruraian tersebut sangat dipengaruhi oleh pH, tetapi bila asam kuat pH tidak mempengaruhi peruraian. • Sehingga besarnya konsentarsi H+ akan menunjukkan berapa bagian asam akan terurai. • Base lemah akan profil yang sama,tetapi makin kecil pH makin besar harga U.Harga disosiasi dapat dilihat pada rumus 21, yang dapat dinyatakan pada rumus 22.  = U/u (22)

  24. pKaI +Pka2 U1/U2-[Ka1/Ka2]½ pHOPT =  -Log  (23) 2 1-{(U1Ka1)/U2Ka2}½ • Untukmendapatkan pHoptimundalampemisah an berbagaisenyawadirumuskansebagaiberikut: • Harga log padarumus 23 dapatdiabaikanmakarumusmenjadi: • Persamaanrumusuntukbasadanasam yang lain, dalammencaripemisahan yang balk berpedomanpadapka yang paling lambatmobilitasnya • Pergeseran pH setiap 0,1 unit akanmempenga- ruhirasiomobilitasantara 0,6 sampai 1,5 • Maka optimum pHuntukpemisahanterlihatlangsungdarigambardiatas.dengansyarat: medium atausuportingtidakmempengaruhi, pKa1+pKa2 . pHopt= ———— (24) 2

  25. [H+] =Ka1Ka2 (25) • Bilarasiomobilitaslebihbesardariangkatersebut, maka pH diatur agar senyawaterionisasisempurna.kalauasamataubasabervalensi 2, dirumus- kansebagaiberikut: • Prosesionisasi, danhargamobilitasasam • Divalenadalah: presentaseionisasi Keterangan • pKa1+pKa2 • Atau: pH=  (26) • 2 D(B+2) = 100(u/U)= 50  (27) D + D/(B+l) [H+] HARGA B=Ka1/Ka2 D =  [Ka1Ka2]

  26. PEBGARUH BOBOT MOLEKUL • Conway (1977), dan thornburg, bahwa bobot molekul (W), mempunyai pengaruh sekitar 20 % dirumuskan • MA adalah mobilitas relatif terhadap pembanding amarant, dan z adalah valensi migran. 100 MA dapat pula diganti AM, yang menyatakan harga mobilitas migran. • Diteliti pengaruh bobot molekul dalam pemisahanberbagai senyawa menyatakanbahwa untuk menempuh jarak 15 cm, bagi senyawa normal /pembanding ditempuh selama 6, 15, 31 menit untuk senyaw a berbobot molekul 50, 200 dan 600 dalton. • Sesuaidenganpercobaanyangdilakukanpadaanalisis peptida dengan fase diam poliakril amida,26 100 MA800 ——— = ——— (28) Z W

  27. Contoh: Menempuh jarak yang sama AM 60 200 600 AM 60 200 600 MenempuhWaktu yang sama

  28. Ternyata pemisahan lebih banyak tergan tung pada bobot molekul dari pada muatannya. • .Penelitian Gross, untuk memisahkan turunan n­alkilamin dengan kondisi larutan asam formiat 0,75 m, pH 2 voltase ber tingkat 100 V/cm selama 17 menit.Nonilamin bergerak sepanjang 12 cm yang terpisahdaridesilamin • Keduanyamempunyaiselisihbobot molekul sebesar 9%.Hal itu belum dapat digunakan sebagai pedoman pemisahan, tetapi dapat digunakan sebagai parameter. Pemisahan • Dapat disempurnakan dengan memberikan yang lebih lama , maka akan terlihat perbedaan kecepatan rambatnya atau migrasinya

  29. C.ALAT/INSTRUMENTASI • Alat yang dipasarkandanbanyakdigunakanadalahjenisselektrofpresis zone ataubercak. Sedangkanproduk yang ditawarkanadalah: • 1. Elektroforesis slab • 2. Elektroforesistabung • 3. Elektroforesiskertas • 1.Elektroforsis slab (lapisantipis) • Elektroforesislapisantipistersebutmenggunakanfasediam (media) berupalapisantipis yang dapatdiproduksiolehpabrikmaupundibuatsendiri. • Cara perlakuannyadilakukansecaravertikalmaupun horizontal.Elektroforesislapisantipis (el. T), digunakanlempengdarikacasepertihalnyaKLT, dancaraelusinyategaklurus (gambar 6). • (B) Lempengelektroforesis temp at penotolansampeldenganpengarahnya • Denganalattersebutpercobaandapatdilakukanbaikdengancarapendinginan, menggunakanaliran air dingin, ataucarapenyiraman. Ukuranalatbervariasi, karenaitulempeng yang digunakandisesuaikandengantangkinya.

  30. Anode Katode Totolan sampel • Contoh: • Elektroforesis dua demensi seperti pada KLT. Digunakan untuk campuran yang sangat kompleks seperti asam amino dari hasil peruraian protein. Asalkan ukuranbujur sangkar. • Yang dianalisis hanya satu jenis ionik (muatan nya positif atau negatip) sehingga memudahkan arah gerakanion. • Untuk menyempurnakan pemisahan pada Elektroforesis Lapisan Tipis (ELT), dapat mengubah pH sehingga dapar medium yang diganti, berbeda dengan KLT yang diubah adalah eluen, (polar atau non polar) Lempeng elektroforesis Penyangga

  31. Sisir pemegang lempeng Anode Bila pada klt merubah komposisi eleuen, tetapi pada elt yang dirubah ph elektrolitny a. ` • Dengan tangki tersebut dapat dilakukan pemisahan menggunakan belasan lempeng sekaligus, asal jenis protein atau senyawa yang dianalisis sama, sehingga pH elektrolit tidak perlu diubah-ubah. • Lempeng elektro- foresis dapat digunakan untuk melakukan elektroforesis bertingkat. • Metode ini berbeda dengan KLT, elektroforesis bertingkat adalah lapisanpendukungnya. Yang berbeda porositasnya. Lempeng Lempeng ````` Katode Tangki Cairan elektrolit

  32. Contoh elektroforesis tegak Beberapa ukuran sisir pemegang lempeng Gambar elektroforse tegak

  33. Electrophoresis Equipment Combs are used to put wells in the cast gel for sample loading. • Regular comb: wells separated by an “ear” of gel • Houndstooth comb: wells immediately adjacent

  34. Elektroforesis lempeng mendatar • Cara pemisahan yang mendatar, asal jenis protein atau senyawa yang dianalisis sama, sehingga pH elektrolit tidak perlu diubah-ubah. • Lempeng elektroforesis dapat digunakan untuk melakukan elektroforesis bertingkat. +

  35. Dengan cara itu mobilitas tiap segmen berbeda kecep atannya. • Elektroforesis lempeng mendatar mirip dengan elektroforosis tegak, dan elektrodenya dapat diganti lihat gambar. • Alat itu dapat digunakan dengan berbagai tipe kete­balan lempeng karena sisir penyangga ber­beda-beda ukurannya. • Sedangkan alat elektroforesis mendatar dapat dilihat pada slide 32 elektroforesis lempeng mendatar pada alat ini lapisan fase diam diletakkan mendatar dan bertumpuk atas- bawah sehingga dapat digunakan untuk tiga sampai empat lapisan. porusnya kecil(rapat) porusnya besar

  36. Dengan elektrofoseistersebut dapat dipisahkan senyawa­senyawa dengan jumlah besar. Tinggi camber sekitar 50 cm, atau lebih sehingga pemisahannya lebih sempurna, • Elektroforesis dapat juga digunakan secara preparatif, untuk pemisahan sampel yang berjumlah besar, dengan menggunakan banyak tabung. • Walaupun waktu yang diperlu­kan lama. Dengan alat tersebut percobaan dapat dilakukan baik dengan cara pendinginan, menggunakan aliran air dingin, atau cara penyiraman. Ukuran alat bervariasi, karena itu lempeng yang digunakan disesuaikan dengan tangkinya.

  37. 2. ELEKTROFORESIS TABUNG • Elektroforesis ini seperti halnya kolom kroma­tografi, tetapi sampel ditepi. Alat opersional elektroforesis tabung atau sel. Ini dapat digunakan untuk beberapa tabung sekaligus • Elektroforesispendingin udarabentuk pipa u (moving bounderies) • Dengan tangki tersebut dapat dilakukan pemisahanmenggunakan belasan tabungsekaligus, asal jenis protein atau senyawa yang dianalisis sama, (slide 36)

  38. Contoh elktroforesiss mendatar dan tegak bentuk tabung

  39. Elekttofpresisn bentuk tabung tegak Larutan dapar atas Tabung elektroforesis Larutan dapar bawah Elektrode

  40. Elektrofosresis tersebut dapat digunakan untuk analisisi secara, kuanti tatif, dan kualitatif maupun preparatip.(Slid 36) • Satu contoh alat elektroforesis yang digunakanuntuk preparatif seperti gambar slide 36a. • Tiga tabung elektroforesis yang kecil-kecil dapatdiganti dengan satu tabung besar untuk elektroforesis preparatif. • Bila sampel diubah menjadi satu jenis ion maka penotolannya diletakkan diujung salah satu elektrodenya. Padagambar lob, terllhat tiaptabung dihubungkan dengan elektode tersendiri. Arus listrlk yangdiberi- kan dari satu sumber, • Kemudian didalam alat arus tersebut dibagi, sehingga tiap tabung mendapat tegangan yang besarnya sama. • Tiap lempeng atau tabung yang digunakan akan mendapat perlakuan sama sehingga tidak ada perbedaan mobilitas migran.

  41. Tutup dan untuk menahan pendingin Lempeng + + Penyangga C Elektroforesis Cairan disemprotkan B. Elektroforesis dengan pendingin udara A. Elektroforesis bentuk pipa U (moving boundery) + + E Elektroforesis pendingin logam dibawah dabn diatas D Elektroforesis pendingin logam dibawah

  42. Media elektroforesis 3. ELEKTROFORESIS DENGAN KERTAS • Jeniselektroforesisini paling duludiketemukan, tetapisampaisekarangmasihdigunakan. Elek­troforesisiniselainmenggunakankertasseringmenggunakanlapisanseluloseasetatuntukmemisahkan protein. (Sl • Berbagaibentukelektroforesiskertasterlihatdalam slide 40 lapisantipisdigantikertas. , • Salahsatujeniselektroforesis yang berbentukpipa u yang semuladigunakanuntukmengujimobilitas ion, yang jugadisebut moving boundery.

  43. 4.Teknik Elektroforesis • A.Tipe pembuatan • (1). Pembuatan lapisan tipis • Cara pembuatan dap`at dilakukan seperti pembuatan lapisan tipis pada klt, hanya saja bahan yang digunakan berbeda • Bahan itu antara lain, agrose, selu lose asetat, dan poliakrilamid (bio-rad, 1983). • Dengan alat ini dapat dipisahkan senyawa dengan jumlah besar tentu saja seperti terdapat sisir yang besar sehingga perlakuan elektroforetiknya dapat dilakukan dengan fase diam yang lebih tebal.

  44. Sampel yang ditotolkankandalambentukpemisahanstripakanlebihbanyak. • Pendukungkertas (sebagaifasediamkertas) • (A). Bahaninimudahdidapat, tidakperludipersiapkankhusus,tinggalmemotongsesuaiukuran, kertas yang dipakaiadalahjeniswhatman no.1, untukkromatografi. Mempunyaisifatpokok ant ara lain: • (B).Dayaadsorbsinyabesar, dapatditurunkandenganmenggunakandapar yang lebihbasa, danteganganlistrikdinalkan. Tetapiph harusdiper­hatikan, karenasangatberpengaruhterhadapmobilitas ion. • (C). Karenasifatkimiadankonstruksinya, Menyebabkantimbulnyaelektroosmosistak rata.

  45. D) Kertas mempunyal porus yang besar, sehingga menyebabkan terjadinya difusi molekuler bagi senyawa berbobot molekul kecil. Hal tersebut dapat diatasi dengan menaikkan tegangan listrik. • (2). Selulose asetat • Semula digunakan sebagai pengganti kertas, pada kenyataan menjadi lebih praktis dan murah, dan dengan alat yang dikembangnkan cara menyiapkan lebih mudah, sehingga lebih banyak dipakai. • (a). Daya pisah kuat dan waktu yang digunakanpendek, karena pori kecil, dan homogen maka senyawa makromolekul dan mikro molekul cepat terpisah. • (b). Biaya yang diperlukan lebih murah, dandengan ukuran pendek sudah dapat memisahkandengan balk.

  46. (c).Bahkan dalam perdagangan sudah terse- dia. • (d). Gugus hidroksil lebih sedikit sehingga Sifat hidrofiliknya lebih rendah dari pada kertas, maka interaksi yang terjadi antara migran dan pendukung jadi berkurang. • (e). Dapat digunakan untuk immonoelektro foresis, serta sampel juga mudah dipisahkan dari selulose asetat. ` • (3). PENDUKUNG PATI • Pati dicampur dengan larutan dapar yang, Digunakan. Campuran tersebut dipanaskan sampai menjadi gel dengan diaduk agar rata, tak ada gas tertinggal. • Kemudian dihamparkan pada lempeng kaca seperti membuat lapisan tipis.

  47. (4). PENDUKUNG AGAR • Umumnya sudah tersedia tinggal menggunakan, cara pembuatan sama dengan pembuatan pendukung pati. • Lebih baik menggunakan yang sudah jadi karena lebih homogen karena dibuat secara pabrikasi. • (5). Pendukung poliakrilamid • Biasanya untuk pemisahan senyawa makromo lekul. Sebab pori dapat disiapkan dengan ukuran tertentu. • Memberikan pemisahan secara cepat, dan adsorsi serta elektroosmosis yang rendah. Tidak menyerap sinar uv maka memudahkan untukmelakukan kuantitasi dengan sinar uv. Migran dapat direaksikan dengan pereaksi warna dan diuji dengan tlc scanner

  48. B. TEKNIK PENOTOLAN SAMPEL • Penotolan sampel dapat digunakan apli kator otomatik ataupun manual. Bila cara manual dapat digunakan templet seperti terlihat pada gambar berikut

  49. Penotolan dapat dilakukan ditengah/ditepi berupa bercak, atau berupa strip dan tergantung muatan sampel. Pada penotolan, alat penotol tidak boleh menyentuh bahan pendukung agar tidak berlubang. (Lihat pada aplikator penotolan klt), sebagai contoh penotoloan terlihat padagambar slid48 • C PENGGUNAAN • Elektroforesis selain untuk pemisahan pada uji kualitatif dapat digunakan untuk pemisahan secara preparatif dan pemurnian sekaligus.Slide 49, merupakan hasil pemisahan beberapa protein secara elektroforesis.Protein bobot molekulmiosin 200.000 galaktosidase 116.250 i . fosforllase 92.500

  50. Membandingkan BM Protein Elektroforegram Coomassie Blue Staining

More Related