聚合酶链式反应 Polymerase Chain Reaction ( PCR)

1. 聚合酶链式反应Polymerase Chain Reaction (PCR) 实验三

2. 实验原理 PCR技术类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

4. 实验材料和试剂 • 引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则： • 引物长度约为16-30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高； • 引物中G+C含量通常为40-60%，可按下式粗略估计引物的解链温度：Tm＝4(G+C)+2(A+T)； • 四种碱基随机分布，在3’端不存在连续3个G或C，这样易导致错误引发； • 引物3’端最好与目的序列阅读框架中密码子第一或第二位核苷酸对应，以减少由于密码子摆动产生的不配对； • 在引物内，尤其在3’端应不存在二级结构； • 两引物之间尤其在3’端不能互补，以防出现引物二聚体，减少产量。两引物间最好不存在4个连续碱基的同源性或互补性； • 引物5’端对扩增特异性影响不大，可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等。通常应在5’端限制酶位点外再加1-2个保护碱基； • 引物不与模板结合位点以外的序列互补。所扩增产物本身无稳定的二级结构，以免产生非特异性扩增，影响产量。

5. 4种三磷酸脱氧核苷酸(dNTP)：dNTP应用NaOH将pH调至7.0，并用分光光度计测定其准确浓度。dNTP原液可配成5-10mmol/L并分装，-20℃贮存。一般反应中每种dNTP的终浓度为20-200μmol/L。理论上4种dNTP各20μmol/L, 足以在100μL反应中合成2.6μg的DNA。当dNTP终浓度大于50mmol/L时可抑制Taq DNA聚合酶的活性。4种dNTP的浓度应该相等，以减少合成中由于某种dNTP的不足出现的错误掺入； Mg2+：Mg2+浓度对Taq DNA聚合酶影响很大，它可影响酶的活性和真实性, 影响引物退火和解链温度，影响产物的特异性以及引物二聚体的形成等。通常Mg2+浓度范围为0.5-2mmol/L。对于一种新的PCR反应，可以用0.1-5mmol/L的递增浓度的Mg2+进行预备实验, 选出最适的Mg2+浓度。在PCR反应混合物中，应尽量减少有高浓度的带负电荷的基团，例如磷酸基团或EDTA等可能影响Mg2+离子浓度的物质，以保证最适Mg2+浓度；

6. 模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率；模板：PCR反应必须以DNA为模板进行扩增，模板DNA可以是单链分子，也可以是双链分子，可以是线状分子，也可以是环状分子。就模板DNA而言，影响PCR的主要因素是模板的数量和纯度。模板量过多则可能增加非特异性产物。DNA中的杂质也会影响PCR的效率； Taq DNA聚合酶：一般Taq DNA聚合酶活性半衰期为92.5℃ 130 min，95℃ 40min，97℃ 5min。Taq DNA聚合酶的酶活性单位定义为74℃下，30min，掺入10nmol/L dNTP到核酸中所需的酶量。Taq DNA聚合酶的一个致命弱点是它的出错率，一般PCR中出错率为2×10-4核苷酸/每轮循环，在利用PCR克隆和进行序列分析时尤应注意。在100μL PCR反应中，1.5-2单位的Taq DNA聚合酶就足以进行30轮循环。所用的酶量可根据DNA、引物及其它因素的变化进行适当的增减。酶量过多会使产物非特异性增加，过少则使产量降低； 反应缓冲液：反应缓冲液一般含10-50mmol/L Tris•Cl (20℃下pH8.3-8.8)，50mmol/L KCl和适当浓度的Mg2+。Tris•Cl在20℃时pH为8.3-8.8，但在实际PCR反应中, pH为6.8-7.8，50mmol/L的KCl有利于引物的退火。另外，反应液可加入5mmol/L的二硫苏糖醇(DDT)或100μg/mL的牛血清白蛋白(BSA)，它们可稳定酶活性，另外加入T4噬菌体的基因32蛋白则对扩增较长的DNA片段有利。各种Taq DNA聚合酶商品都有自己特定的一些缓冲液。

7. 实验仪器 PCR仪

8. PCR扩增体系（以50μL为例） 依次混匀下列试剂 • 35μLH2O • 5μL10×PCR反应缓冲液 • 4μL 25mmol/L MgCl2 • 4μL4种dNTP • 0.5μL 上游引物（引物１） • 0.5μL下游引物（引物２） • 0.5μL模板DNA(约1ng)

9. PCR反应条件： 94℃3min 94℃ 30sec 50℃30sec 72℃ 80sec Cycle 40 72℃ 10min 注：根据实际情况可调整退火温度，变性时间，退火时间等参数

10. PCR反应步骤 1.按PCR扩增体系将反应物一一加入，混合均匀。 2. 根据计算好的PCR反应条件为实验用PCR仪设定反应程序。 3. 反应结束后，电泳检测反应产物及长度。 4. PCR产物的纯化 （酚/氯仿法） • 取反应产物加100μLTE。 • 加等体积氯仿混匀后用微型离心机10000rpm离心15s,用 • 移液器将上层水相吸至新的小管中。这样抽提一次, 可除去覆盖在表面的矿物油。 • 再用酚:氯仿:异戊醇抽提二次,每次回收上层水相。 • 在水相中加300μL95％乙醇,置-20℃下30min沉淀。 • 在小离心机上10000rpm离心10min,吸净上清液。加入1mL70％乙醇，稍离后,吸净上清液.重复洗涤沉淀2次。将沉淀溶于7mL ddH2O 中，待用。

11. 示例电泳结果 1 2 3 4 5 M M：DNA marker 1：为阳性对照 2：为阴性对照 3-5：为扩增出的DNA条带

12. 实验注意事项 • EB是强诱变剂并有中等毒性，配制和使用时都应戴手套,并且不要把EB洒到桌面或地面上。凡是沾污了EB的容器或物品必须经专门处理后才能清洗。沾染了EB的实验垃圾需专门回收处理。 • 观察DNA离不开紫外透射仪，可是紫外光对DNA分子有切割作用。从胶上回收DNA时，应尽量缩短光照时间并采用长波长紫外灯(300-360nm），以减少紫外光切割DNA。 • 每加完一个样品要更换tip头，以防止互相污染，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部凝胶刺穿。

13. 思考题 • 降低退火温度对反应有何影响？ • 延长变性时间对反应有何影响？ • 循环次数是否越多越好？为什么？ • 如果出现非特异性带,可能有哪些原因？