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Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs. Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette INSERM U366 - CEA Grenoble Sous la direction de Didier Job et Odile Valiron. Plan. Introduction : le cytosquelette microtubulaire. Objectifs.

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Presentation Transcript
instabilit chimique dans les solutions microtubulaires tude et recherche d effecteurs

Instabilité chimique dans les solutions microtubulaires : étude et recherche d’effecteurs

Thèse préparée au laboratoire du cytosquelette

INSERM U366 - CEA Grenoble

Sous la direction de

Didier Job et Odile Valiron

slide2
Plan
  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire
  • Objectifs
  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
  • Conclusions et perspectives
slide3
Plan
  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire
  • Objectifs
  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
  • Conclusions et perspectives
assemblage des microtubules
Assemblage des microtubules
  • Eléments requis :
    • Concentration critique, température minimale
    • Source d’énergie: GTP
    • Solution adéquate (tampon, magnésium)

L’assemblage est réversible, nécessite de l’énergie, atteint un état stationnaire hors d’équilibre

nucl ation des microtubules

Oligomères

Feuillets

Nucléation des microtubules

DIMERES

MICROTUBULES

etat stationnaire

-

+

Instabilité dynamique

Treadmilling

50

Longueur (µm)

30

10

0

2000

4000

Temps (s)

Etat stationnaire
  • Consommation d’énergie à l’état stationnaire

Flux de sous-unités

dynamique des microtubules in vivo

Mitose

Interphase

Dynamique des microtubulesin vivo
  • Une architecture dynamique
  • Modifications du réseau au cours du cycle cellulaire
  • Renouvellement permanent des microtubules
  • Instabilité dynamique « tempérée »
  • Treadmilling
contr le de la stabilit des microtubules
Contrôle de la stabilité des microtubules
  • Protéines stabilisant les microtubules
    • MAP1, MAP2, Tau, E-MAP115, MAP 4
    • Lis1, Doublecortine
    • XMAP230, XMAP215, TOGp
    • STOP
  • Intégrateurs du cytosquelette
    • Plakines, BPAG1 (microtubules, neurofilaments)
    • MACF (microtubules, actine)
  • Protéines déstabilisantes
    • Stathmine, SCG10
    • XKCM1, Kar3p
    • Rev
modulation du turnover des microtubules
Modulation du turnover des microtubules
  • Protéines liant l’extrémité plus des microtubules
    • Bim1, EB1, EB2
    • Tip1p
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Plan
  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire
  • Objectifs
  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
  • Conclusions et perspectives
objectifs
Objectifs
  • Réévaluation des facteurs contrôlant la dynamique des microtubules
  • Obtention et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de la dynamique des microtubules
slide15
Plan
  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire
  • Objectifs
  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
  • Conclusions et perspectives
facteurs contr lant la dynamique des microtubules
Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules

Mise au point de dosages

 Mesure simultanée de

- concentration en tubuline-GTP

- « masse » de tubuline assemblée

- distribution de longueurs des microtubules et longueur moyenne

 [Tubuline-GTP](t)

 m(t)

 l(t)

 [MT](t)

Tubuline complexée au GTP sans excès de GTP

Pas de système régénérateur du GTP

 la tubuline n’assemble qu’une seule fois

r actions d assemblages

Vitesse et amplitude augmentent

  • Symétrie des courbes
Réactions d’assemblages
  • Désassemblage en dessous de la concentration critique
nucl ation des microtubules1
Nucléation des microtubules
  • Vitesse de formation de nouveaux microtubules :
  • Indépendante de la concentration instantanée en Tubuline-GTP
  • Fortement dépendante de la concentration initiale en Tubuline-GTP
  • Exposant de nucléation : environ 6,2
elongation des microtubules1
Elongation des microtubules

Vitesse d’élongation indépendante de :

- concentration instantanée de tubuline-GTP

- concentration initiale en tubuline-GTP

 Limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules ?

d sassemblage des microtubules
Désassemblage des microtubules

Des facteurs de catastrophes

 des oligomères ?

Désassemblage par catastrophes

Indépendant de la longueur

facteurs contr lant la dynamique des microtubules1
Facteurs contrôlant la dynamique des microtubules
  • Nucléation : un intermédiaire stable entre les dimères de tubuline et les microtubules
  •  Des oligomères de tubuline ?
  • Elongation limitée par les propriétés intrinsèques des microtubules
  •  Fermeture de feuillets
  • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophe
  •  Des oligomères facteurs de catastrophes ?
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Plan
  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire
  • Objectifs
  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
  • Conclusions et perspectives
recherche d oligom res de tubuline contr lant la nucl ation des microtubules
Recherche d’oligomères de tubuline contrôlant la nucléation des microtubules
  • Production d’assemblages de tubuline stabilisés par pontage covalent
    • Protocole dérivé de méthodes de production « d’amorces » de microtubules : pontage modéré
  • Assemblage de microtubules puis traitement modéré à l ’EGS
  • Collecte des fragments de microtubules stabilisés
  • Filtration éliminant les particules de plus de 100 nm
caract risation des solutions d oligom res de tubuline
Caractérisation des solutions d’oligomères de tubuline
  • Les solutions d’oligomères stimulent l’assemblage des microtubules sous la concentration critique
  • Absence de fragments de microtubules dans les solutions
  • - filtration 100 nm
  • - observation en immunofluorescence
caract risation des solutions d oligom res

Diffusion de lumière

Microscopie électronique

Caractérisation des solutions d’oligomères
  • Uniquement des dimères (env. 8 nm) et des oligomères (env. 42 nm)
  • Des oligomères linéaires
structure des oligom res

Association latérale

Association longitudinale

Feuillet

Structure des oligomères
  • Liaison de GTP par le dimère de tubuline
  •  échangeable sur la sous-unité b
  • Structures possibles des oligomères
propri t s de liaison du gtp par les oligom res
Propriétés de liaison du GTP par les oligomères

Echange du GTP des oligomères contre du GTP radioactif

 Des oligomères formés par association latérale de dimères

Affinité plus faible

Echange plus lent

 contraintes liées au pontage ?

m canisme de nucl ation des microtubules par les oligom res

 Exposant de nucléation

Concentration en microtubules

Mécanisme de nucléation des microtubules par les oligomères

Tubuline assemblée

Longueur moyenne des microtubules

exposant de nucl ation
Exposant de nucléation

 Environ 4 oligomères sont nécessaires pour former un nouveau microtubule

caract risation d un interm diaire de nucl ation
Caractérisation d’un intermédiaire de nucléation
  • Des oligomères linéaires formés par association latérale de dimères
    • 42 nm  environ 10 dimères
    • Taille + diffusion dynamique de la lumière  65% de tubuline sous forme oligomérique
  • Exposant de nucléation : environ 4
    • 4 oligomères se combinent pour former un microtubule  formation d’un feuillet ?
  • Les microtubules ne désassemblent pas spontanément
    • Absence de facteurs de catastrophes ?
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Plan
  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire
  • Objectifs
  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
  • Conclusions et perspectives
partenaires de la tubuline
Partenaires de la tubuline
  • Un nombre limité de partenaires
  • Des partenaires variables selon la nature des extraits
prot ines identifi es
Protéines identifiées
  • MAPs et moteurs MAP2, KIF21A
  • Protéines de la famille EB EB1, EB2
  • HSPs HSP70, HSP90
  • Enzymes du métabolisme Citrate lyase
efficacit de la m thode
Efficacité de la méthode
  • Identification de protéines liées au cytosquelette microtubulaire
    • Identification toujours en cours
    • Utilisation d’extraits cellulaires humains (séquençage achevé)
    • Grande diversité d’extraits cellulaires possibles
  • Purification de partenaires interférant avec l ’assemblage
    • Exposition des domaines de la tubuline impliqués dans l’assemblage
  • Possibilité de tests fonctionnels en sortie de colonne
    • Identification d’effecteurs de la nucléation, de facteurs de catastrophes
slide36
Plan
  • Introduction : le cytosquelette microtubulaire
  • Objectifs
  • Facteurs contrôlant la cinétique d’assemblage des microtubules
  • Caractérisation d’oligomères stimulant la nucléation des microtubules
  • Recherche de nouveaux effecteurs de l’assemblage des microtubules
  • Conclusions et perspectives
conclusions
Conclusions
  • Facteurs contrôlant l’assemblage des microtubules
    • Nucléation en deux étapes (oligomères ?)
    • Elongation limitée par les propriétés structurales des microtubules
    • Désassemblage limité par la fréquence de catastrophes
      • Facteurs de catastrophes = oligomères?
  • Stabilisation et caractérisation d’oligomères de tubuline stimulant la nucléation des microtubules
    • Stabilisation de fragments de microtubules par pontage covalent modéré
    • Oligomères formés par association latérale d’environ 10 dimères
    • Environ 4 oligomères nécessaires pour former un microtubule
  • Identification de partenaires de la tubuline
    • Des partenaires identifiés « qui font sens »
    • Identifications en cours
perspectives
Perspectives
  • Des outils pour étudier les effecteurs du cytosquelette
    • Mesure de l’activité sur la nucléation, l’élongation, le désassemblage
    • Etude détaillée de la nucléation à partir des oligomères
    • Recherche de facteurs de catastrophes
    • Réalisation d’un  « protéome » des partenaires de la tubuline
  • Transposition aux études cellulaires
    • Effet des oligomères de nucléation dans les cellules