CHAPTER 6 植物胚胎培养

CHAPTER 6植物胚胎培养 第一节植物胚胎培养第二节植物胚乳培养第三节植物的离体受精

第一节植物胚胎培养 一、胚胎培养的意义 1.克服受精不育对由于胚乳早期败育引起的胚败育。 2.打破种子休眠种胚发育不全、抑制物质抑制种胚发芽 3.缩短育种周期针对柑橘等多胚植物不定胚对合子胚的生长干扰。

4.克服种子生活力低下，提高萌发率 5.克服种子的自然不育性针对长期进行营养繁殖而又具有形成种子能力的植物，其种子往往失去活力。 6.种子生活力快速鉴定测定休眠种子的生活力，快速有效。

二、胚胎培养的内容 植物胚培养成熟胚培养幼胚培养胚珠培养未受精胚珠培养受精后胚珠培养胚乳培养试管受精

三、合子胚培养 胚培养在植物育种中的应用已有约一个世纪的历史。在被子植物中，Hanning（1904）最早在无菌条件下，对辣根菜和胡萝卜的成熟胚进行了离体培养，后来，由许多植物的离体成熟胚培养获得了植株。胚培养为研究胚的发育及各发育期所需营养条件、整体胚与其各部分的再生潜力提供了条件，为建立稀有杂种提供手段（对哪些因胚乳发育不良而导致胚夭折的种、属间杂种有效）。

1、离体胚培养的方法 A、成熟胚培养：指对已形成子叶的种胚的培养。如种子发芽。将果实和种子，用药剂进行表面灭菌，然后在无菌条件下，剥离种胚接种在培养基上，使之发育形成完整的植物体。 B、幼胚培养：指对胚龄处于原胚期、球形期、心型期、早鱼雷期的幼胚的培养。这几个时期幼胚从生理至形态均未成熟。将子房进行表面灭菌，然后在无菌条件下，剥离胚珠进行预培养。一定时间后，在将胚从胚珠中剥离出来进行培养。（胚乳看护培养）

2、幼胚的早熟萌发与防止 幼胚的早熟萌发（Precocious gemination）—— 指幼胚在离体培养条件下，越过正常胚胎发育阶段，在未达到生理和形态成熟的情况下，萌发长成幼苗的现象。早熟萌发形成的幼苗往往畸形、细弱，甚至不能存活。所以，离体培养幼胚需要防止早熟萌发。防止方法：增加培养基中糖和无机盐的浓度，提高培养基渗透压。

3、胚柄在胚培养中的作用 不同发育时期的幼胚，离体培养成功率差异较大。一般胚龄越大成功率越高，胚龄越小成功率越低。胚柄的存在对幼胚能否成活至关重要。胚柄在离体培养中对胚的作用机理还不清楚，可能跟胚柄能合成并向胚提供生长发育所需物质（激素？）有关。

4、胚培养的培养基 糖：高浓度的糖，一方面做能源和碳源；另一方面作渗透压调节剂维持高水平的渗透势，并防止幼胚的早熟萌发。多用蔗糖，也可用甘露醇替代。无机盐：氨盐和无机氮的存在有利于幼胚的成活和发育。氨基酸和维生素：氨基酸有利刺激幼胚生长；但维生素不一定是必需的，依不同种而定。生长调节物质:离体胚的正常发育不需添加激素。但若要诱导愈伤组织则需外加一定的激素。 pH值：胚培养要求一定的pH范围，否则生长抑制。

5、培养条件 光照：通常认为胚培养不需要光照，因为胚是在胚珠内发育的。光照对胚胎发育有轻微抑制作用，随培养时间和胚生长的进行，光照条件要逐步改变。温度：因种类而异，与器官培养差异不大。

第二节胚乳培养 胚乳性质独特，在被子植物中，它是三倍体组织。胚乳是胚发育的主要营养组织。它是一种均质的薄壁细胞组织，完全没有维管成分的分化。在离体条件下，可无限增生和进行器官分化，并可形成三倍体的再生植株。在胚乳培养中，除少数寄生或半寄生植物可以直接从胚乳分化器官以外，绝大多数被子植物的胚乳，无论成熟还是未成熟，都要先经历愈伤组织阶段，然后才能分化出植株。

1、胚乳培养的意义 A、三倍体育种三倍体植株生长健壮，主要特征是败育，对于不需要种子的生产，具有较大优势。如无籽西瓜。三倍体的获得，传统方法是把四倍体和二倍体进行杂交，但杂交往往并不能成功，三倍体种子的来源就没有保障。可用胚乳进行培养获得三倍体植株。 B、生物合成研究胚乳是主要的营养贮存器官，利用胚乳培养体系可研究某些天然产物如淀粉、蛋白质和脂类等的生物合成。

2、胚乳培养的方法 带胚培养和不带胚培养。胚乳愈伤组织器官发生或胚状体发生再生植株

3、胚乳发育时期对培养的影响 不论是核型还是细胞型，处于发育早期的胚乳不仅接种操作不方便，而且愈伤组织诱导率也很低；处于旺盛生长期的胚乳最容易诱导出愈伤组织；接近成熟或完全成熟的胚乳，愈伤组织诱导频率很低，甚至不能产生。

4、胚在胚乳培养中的作用 在胚乳培养中是否必须有原位胚的参与，主要和接种时胚乳的生理状态或胚乳年龄有关。未成熟胚乳，尤其是处于旺盛生长期的未成熟胚乳，无须原位胚的参与就能形成愈伤组织；而完全成熟，特别是种子的胚乳，生理活动十分微弱，在诱导其分化形成愈伤组织之前，必须首先借助与原位胚的萌发使其活化，这种活化可能是由于胚萌发时能产生某种物质，可能是类似GA之类的物质。

5、胚乳再生植株的染色体倍性变异 在胚乳培养中，胚乳愈伤组织及再生植株的染色体数常常发生变化。如：苹果（2n=34）胚乳植株染色体数分布范围是29～56，多数是37～56，真正三倍体细胞只占2～3%。造成染色体数目不稳定的因素： A、胚乳类型 B、胚乳愈伤组织发生的部位 C、培养基中外源激素的种类和水平 D、继代培养时间的长短

第三节植物的离体受精 从花粉萌发到受精形成种子，从种子萌发到幼苗形成的整个过程，均在试管内完成，称离体受精，或试管受精。离体受精技术在克服植物受精不育障碍，特别是克服花粉在柱头上不萌发或萌发后花粉管不能伸入花柱，或在花柱中生长缓慢，使配子不能如期融合的障碍有极其重要的作用。

1、离体受精的方法 A、接种胚珠，再撒播花粉 B、接种胎座，再撒播花粉 C、接种子房，再撒播花粉 D、接种同种受粉后的柱头，再接种异种胚珠 E、哺育法：在胚珠表面先蘸有助于花粉发育的培养基，再在胚珠上撒播花粉。

2、影响离体受精作用成功的因素 A、离体胚珠的成活率 B、花粉萌发和花粉管的生长速度 C、花粉的灭菌

3、鉴别受精的标记 试管内的胚珠撒播花粉后，辨别受精与否需要有鉴别标记。对多数植物而言，寻找适合的标记性状是极不容易的事情。玉米的“胚乳直感”是一个较好的标记性状。具有不同颜色胚乳的品种作亲本，如果试管受精成功，子一代胚乳表现父本的颜色。由此可鉴别出是否受精。

离体受精作为技术平台在被子植物有性生殖中的研究离体受精作为技术平台在被子植物有性生殖中的研究

离体受精研究概括 • 我国的胡适宜教授1985年首次从烟草分离出生活的卵细胞。然而，在1991年由德国的一个实验室首次将分离的玉米精、卵细胞体外融合并在1993年获得了可育植株(Kranz等1991，Kranz和Lörz 1993)。1995年小麦精、卵细胞诱导融合，人工合子分裂形成了多细胞团（Kovacs等1995）

一.引入分子生物学方法研究被子植物生殖细胞发育特征一.引入分子生物学方法研究被子植物生殖细胞发育特征 • 1.雄性生殖单位和精子二型性的概念 • 2.被子植物倾向受精的概念 • 3.雌雄配子细胞水平的识别问题

雄配子的分子生物学研究 • Ueda 等 (2000) 从百合的生殖细胞中分离出了3种核心组蛋白基因，它们所编码的蛋白在两个精细胞中含量最高，推测它们与雄配子的染色质浓缩或重新改造有关，并抑制雄配子中的基因表达。 • Southworth 和 Kwiatkowski (1996)、Xu 和Tsao（1997）分别从白菜、百合和玉米的精细胞分离出质膜蛋白。 • Xu等（1999b）从百合的雄配子中鉴定出一特异基因（LGC1），其表达产物位于精细胞表面，推测可能与精、卵细胞的相互作用有关。 • Xu等（2002）构建了烟草精细胞文库，从396个克隆文库中初步筛选出2个在生殖细胞和精细胞中特异表达的NtS1和NtS2基因，其中发现NtS1编码一个多聚半乳糖醛酸酶，推测这个酶在烟草雄配子分化过程中的细胞壁降解中起作用。

Singh等（2002）构建了麝香百合生殖细胞和白花丹精细胞的cDNA文库，在两个cDNA文库中各有一个基因编码相同的氨基酸序列，但两个基因的编码区外则有差异。作者认为这两个基因的功能是参与蛋白质的泛素化，很可能在两个雄配子的发育过程中增加蛋白质的差异，这种差异在雄配子的倾向受精中起作用Singh等（2002）构建了麝香百合生殖细胞和白花丹精细胞的cDNA文库，在两个cDNA文库中各有一个基因编码相同的氨基酸序列，但两个基因的编码区外则有差异。作者认为这两个基因的功能是参与蛋白质的泛素化，很可能在两个雄配子的发育过程中增加蛋白质的差异，这种差异在雄配子的倾向受精中起作用上述这些研究对于揭示雄配子发育的分子机制及受精过程有关雌、雄配子的识别过程迈出了重要的一步。

雌配子的分子生物学研究 • Dresselhaus等（1994）在用数量很少的细胞构建cDNA文库获得成功后，先尝试做了卵细胞的cDNA文库。他们用128个卵细胞构建出的cDNA文库与体细胞的cDNA文库进行了比较，通过差异筛选首次分离出了被子植物卵细胞中特异表达的基因，为后来研究卵细胞和合子中的特异基因打下了基础。 • Dresselhaus等（1996）又用个卵细胞和104个合子构建了二者的cDNA文库。从玉米卵细胞和合子的cDNA文库中筛选出了50多个不同基因，发现未受精卵细胞中储藏有相当多的翻译启动因子的转录本eIF-5A，这些启动因子可能与卵细胞中的某些mRNA的稳定和翻译有关。

Sauter等（1998）对合子的细胞周期调节基因进行了研究，他们分析了玉米离体的精细胞、卵细胞、中央细胞、助细胞及合子的细胞分裂周期基因cdc2（cdc2ZmA/B）和细胞周期蛋白（cyclin: Zeama;CycB1;2, Zeama;CycA1;1, Zeama;CycB2;1）基因和一种组蛋白基因（histone H3）的表达。Vielle-Calzada（2000）等对拟南芥的早期胚胎发育进行研究，发现好几个来自父本的等位基因的转录在32-64个细胞的幼胚时期才开始。

二.探索被子植物受精机理和合子激活的机理 • 在被子植物精、卵细胞能被分离出之前，对合子激活机理的认识仅靠用电子显微镜进行超微结构观察，这种方法具有很大的局限性。现在由于被子植物离体受精技术的建立，对精、卵细胞的融合过程和合子的发育过程置于显微镜下进行定点、定时的追踪观察，使对被子植物合子激活过程的研究成为可能。

游离钙在合子激活过程中的动态 • Digonnet 等（1997）用玉米离体受精技术研究了被子植物合子激活过程中游离钙的变化动态。在卵细胞和粘附了精细胞的卵细胞中，游离钙的含量没有发生变化。当精卵细胞开始融合时，卵细胞中的钙荧光就扩散到精细胞中，并持续约10秒，直到精细胞完全溶入卵细胞中。精、卵细胞的融合也引起卵细胞中的游离钙的增加，但游离钙的增加状态仅持续2分钟，然后钙荧光又开始下降，到融合后29分钟时，受精卵中的游离钙又恢复到融合前的水平。

Antoine等（2000）又用钙特异振动电极测量了精、卵细胞融合前后外源钙流入受精卵细胞的速度，发现融合前外源钙很少向卵细胞中流入。然而，精、卵细胞融合后，外源钙从融合位点开始向卵细胞中流入，同时钙流入的部位也以1.13 μm/s速度向整个卵细胞表面扩散。 • Han等（2002）向蓝猪耳（Torenia fournieri）成熟的中央细胞中注射精细胞提取物，结果引起中央细胞中游离钙的增高。这种游离钙的增加在注射后的20分钟时达到最高，然后开始下降。他们也试着用玉米精细胞提取物替代蓝猪耳精细胞提取物注射到蓝猪耳的中央细胞中，但并没有引起中央细胞中游离钙的增加。

三.用不同种植物配子融合进行新的远源杂交 体细胞杂种的双亲都处于二倍体状态，融合后的杂种细胞内部很难在短时间内达到一种生理上的一致状态，在体细胞杂交中常出现一方亲本染色体被排除的现象。因此，往往存在着杂种细胞不分裂，杂种愈伤组织不分化，后代长期不稳定等诸多问题。精细胞所含细胞质很少，且其基因组在合子早期不活动，杂种合子中绝大部分细胞质来源于卵细胞，在早期双亲细胞质的矛盾可能不大。玉米卵细胞与小麦、大麦、高粱、薏苡精细胞融合的杂种合子能以23%（9/38）、43%（13/30）、50%（17/34）和78%（21/27）频率形成杂种多细胞团。人工杂种合子的培养也不存在以后杂种染色体减半的问题。

四.利用合子生长的特性改进转基因方法 • 目前在植物基因工程研究中尚未找到一种高效的转基因方法，还存在许多技术问题 ,如受体系统中普遍存在的转基因沉默、转化频率低、转化植株后代遗传不稳定；而且无论是以原生质体、幼胚或愈伤组织还是细胞悬浮系等作为转化受体系统都要经过繁琐的细胞及组织培养过程，这样不仅实验周期长，而且在长期的组织培养过程中，容易产生无性系变异和造成不育、不孕株，影响转化效率。

离体受精及人工合子、自然合子的离体培养与植株再生技术取得了重要进展和突破，为研究植物转基因开辟了新的道路。精、卵细胞和合子具有旺盛的生命力，无论人工合子或自然合子，在离体条件下均有很高的分裂频率并基本遵循胚胎发育途径再生植株（Holm等1994，Kranz和Lörz 1993，Kumlehn等1998，1999）。

Leduc等（1996）首次采用显微注射法向授粉24小时后分离出来的227个玉米合子注射两种报告基因，约3.5%的合子在培养4天后显示出报告基因的瞬间表达。Leduc等（1996）首次采用显微注射法向授粉24小时后分离出来的227个玉米合子注射两种报告基因，约3.5%的合子在培养4天后显示出报告基因的瞬间表达。 • Pónya等（1999）分别向小麦的98个卵细胞注射了带有遍在蛋白启动子的绿色荧光蛋白（GFP）基因，向77个合子注射具35S启动子的GUS基因，两者平均的瞬时表达率分别为46%和52%，远远高于以它的体细胞为受体的转化率。 • Home等（2000）向分离的大麦合子注射了一种具水稻肌球蛋白启动子的GUS基因。被注射的上百个合子中有34%发育为胚状体结构，PCR检测显示21%的胚状体有转入的外源DNA。 • Scholten 和Kranz（2001）向玉米的卵细胞、精细胞、助细胞、中央细胞中注射了具有35S启动子的GFP基因，其中卵细胞、助细胞和中央细胞呈现GFP荧光，而转基因精细胞中没有检测到GFP荧光。

结束语 动物和低等植物的有性生殖机理研究比被子植物深入的多，是因为它们的生殖细胞好操作。利用现代生物技术对分离出来的生殖细胞进行各个层次上的分析研究，就可探索有性生殖的基本规律。如同60年代电子显微镜技术用于植物胚胎学领域中获得了大量的生殖细胞超微结构信息，提高了对生殖细胞形态结构与生理功能的认识一样。现在被子植物离体受精技术的突破，使当今被子植物生殖生物学已进入到一个新的层次。分子生物学方法的应用使植物受精机理的许多问题有望得到解答，同时利用离体受精技术特点，结合转基因技术和细胞杂交技术将有可能成为植物生物工程技术的新热点。

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