ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA - PowerPoint PPT Presentation

slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA PowerPoint Presentation
Download Presentation
ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA

play fullscreen
1 / 62
ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA
303 Views
Download Presentation
armani
Download Presentation

ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA

- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript

  1. ELEKTROHEMIJSKI BIOSENZORI OSNOVE I PRIMENA D. Manojlović, Hemijski fakultet Beograd

  2. DEFINICIJA Biosenzor se može definisatikao uređaj koji imaugrađenu biološki aktivnu komponentuu bliskom kontaktu sa fizičko-hemijskim pretvaračem i procesoromelektronskog signala

  3. Shema biosenzora

  4. Svaki senzor i biosenzor se sastoji od: Pretvarača (transducer) - pretvara uočenu promenu(fizičku ili hemijsku) u mereni signal Prepoznavajućeg agensa– koji omogućava merenje samo one vrste koja nam je od interesa a koja se nalazi u smeši sa drugim vrstama

  5. Elektroaktivna supstanca Elektrode Enzim Poluprovodničke pH elektrode pH promena Električni signal Antitelo Toplota Termistori Mikro-org. Brojač fotona Svetlost Promena mase Piezoelektrični uređaj Ćelija Molekul prepoznavajućimaterijal Pretvarač signala Princip biosenzora

  6. BIOKOMPONENETE Enzimi Antitela Membrane Organele Ćelije Tkiva Receptori

  7. PRETVARAČI Elektrohemijski Optički Piezo-električni Kalorimetrijski Akustični

  8. Enzimi Biološki elementi koji se najčešće koriste Mogu biti korišćeni u čistom obliku ili prisutni u mikroorganizmima ili biljnom materijalu bez prethodnog izolovanja Aktivnost mnogih enzima uključuje oksidaciju i redukciju koje mogu biti detektovane elektrohemijski

  9. Postojipet glavnih klasaenzima. Oksidoreduktaze Transferaza Hidrolaze Liaze Izomeraze

  10. Oksidoreduktaze Dehidrogenaze Oksidaze Peroksidaze Oksigenaze

  11. Prednosti enzima: • lako se vežu za odgovarajući supstrat • visoko su selektivni • imaju katalitičku aktivnost • brzo se aktiviraju Enzimi su najčešće korišćene biološke komponente

  12. Mane enzima: • skupi su • često gube aktivnost dok se imobilizuju na pretvaraču • gube aktivnost posle relativno kratkog vremenskog perioda

  13. Antitela Vezuju se specifično za odgovarajući antigen Prednosti: • veoma su selektivni • ultra osetljivi • veoma se snažno vezuju Jedina mana im je što nemaju katalitički efekat

  14. Nukleinske kiseline slične antitelima koriste se za detekciju genetskih bolesti, kancera i virusnih infekcija DNK istraživanja često uključuju dodatak označeneDNK u sistem dodatkom nekog radioaktivnog elementa ili elektrofore

  15. Metode imobilizacije Povezivanje selektivnih elemenata adsorpcijomselektivnog elementa na površinu kovalentnim vezivanjem mikrokapsulacijom cross-linking – koristi se bifunkcionalni agens da hemijski poveže pretvarač i selektivnu komponentu ‘zarobljavanjem’ - selektivni element se nalazi uhvaćen unutar gela, paste, ili polimera

  16. TIPOVI BIOSENZORA Enzim/metabolički biosenzori • Enzimske elektrode i ćelijske elektrode Bioafinitetni senzori • Antitela • Nukleinske kiseline • Lektin

  17. Enzim/metabolički senzori Supstrat + Enzim Supstrat-enzmski kompleks • Proizvod + Enzim Meri se odnos potrošnje supstrata prema oslobađanju proizvoda i pretvara u kvantifikovani signal

  18. Bioafinitetni senzori Ovi senzori se baziraju na interakcijamapovezivanja između imobilizovanihbiomolekulai analita od interesa. Ove interakcije su visoko selektivne. Pimeri obuhvatajuantitelo-antigen interakcije, nukleinske kiselineza komplementarnesekvence i lektinza šećer

  19. Bioafinitetni senzori

  20. Pretvarači • Potenciometrijski • Amperometrijski • Konduktometrijski

  21. POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI Kod potenciometrijskih senzoraizmereni potencijal na selektivnoj memembraniilielektrodnoj površini, koja je u kontaktu sa rastvorom,povezan je sa koncentracijom analita Potencijal semeri pri nultoj strujii prema referentnoj elektrodi (relativni) pH elektroda jeosnovni potencionetrijski pretvaraču biosenzorima.

  22. POTENCIOMETRIJSKI BIOSENZORI E = Eo + RT/nF ln[analit] • Eo konstanta za sistem • R univerzalna gasna konstanta • T apsulutna temperatura • n broj izmenjenih elektrona • F Faradejeva konstanta • ln[analit] prirodni logaritam od aktiviteta analita.

  23. Najpoznatiji potenciometrijski senzor jejon-selektivna elektroda (ISE) Tečnepolimerne membranske elektorde su komercijalno raspoloživei rutinski se koriste selektivnu detekciju nekoliko jona(K+, Na+, Ca2+, NH4+, H+, CO32-)u složenim biološkim osnovama Antibiotici nonactin ivalinomicinsluže kao neutralni nosači za određivanjeNH4+ i K+

  24. Ag/AgCl referentna elektroda Unutrašnji vodeni rastvor za punjenje Tečni jonoizmenjivač Membrana/soni most Porozna membrana koja sadrži jonoforu

  25. Enzim može biti imobilizovan na pH elektrodi korišćenjem želatina i glutaraldehida

  26. Glukoza glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2enzim:GOD dolazi do promene pH zbog nastanka glukonske kiseline merenjem promene potencijala(pH) možemo odrediti koncentraciju glukonske kiseline (a samim tim i glukoze) pencilinaza Penicin Penicilinska Kiselina U kontaktu sa pH elektrodom.

  27. ISE koje se koristeu kombinaciji saimobilizovanim enzimomamogu da služe kao osnova elektroda koje suselektivne za specifične enzimske supstrate Od njih su dva glavna: za ureu i za kreatinin. Ove potenciometrijske enzimske elektrode seprave ubacivanjem enzima ureaze ikreatinaze na površinu katjon osetljive(NH4+)ISE

  28. Urea CO(NH2)2 + 2 H2O → (NH4)2CO3 koncentraciju uree možemo određivati primenom katjonske amonijum selektivne elektrode ili možemo napraviti alkalni rastvor i određivati slobodni amonijak koristeći amonijum selektivnu gasnu elektrodu Osetljivost odnosno granica detekcije iznosi (10-6 M )

  29. Oksalati C2O42- → 2 CO2 + H2Ooksalat oksidaza Određivanje oksalata u urinu je značajno prilikom dijagnostike hiperokslurije Potenciometrijski pretvarač kod biosenzora koji se koristi za određivanje koncentracije CO2 (odnosno oksalata u mokraći) je CO2 gasna elektroda

  30. Primeri potenciometrijskih senzora

  31. Glukoza Koristimo jodid selektivnu elektrodu glukoza + O2 → glukonska kiselina + H2O2 enzim:GOD H2O2 + 2 I-+ 2 H+ → I2 + 2 H2Oenzim:PO Jodid-selektivna elektroda prati smanjenje koncentracije jodida što je prouzrokovano dejstvom vodonik-peroksida

  32. AMPEROMETRIJSKI BIOSENZORI Kod amperometrijskih biosenzoraelektrodni potencijal se drži na konstantnoj vrednostidovoljnoj za oksidaciju ili redukcijuvrste od interesa(ili supstance elektrohemijski vezane za nju) Jačina strujekoja protiče je proporcijonalna koncentraciji analita Id = nFADsC/d

  33. Pomoćna elektroda ( Pt žica) Radna elektroda Referentna Elektroda ( Pt, Au, C) (Ag/AgCl, SCE) Puferski rastvor (Tris, DPBS, Citrat) Koji sadrži elektrolit ( KCl, NaCl) e tok Mešalica

  34. Primer Glukoza + O2 Glukoza Glukonska kiselina + H2O2 Oksidaza Proizvod, H2O2, se oksidovuje na +650mV u odnosu na Ag/AgCl referentnu electrodu. Zbog toga se primenjue potencijal od +650mV i meri oksidacija H2O2 . Struja je direktno proporcionalna koncentraciji glukoze.

  35. I (nA) 150 100 50 0 5 10 15 20 [Glukoza], mM

  36. Amperometrijske enzimskeelektrode koje se baziraju na oksidazamau kombinaciji sa vodonik proksid indikatorskim elektrodamapostale su najuobičajeniji biosenzori Kod ovih reakcija prati se,potrošnja kiseonika ili proizvodnja vodonik peroksida Prvi razvijeni biosenzorbazirao se nakorišćenjukiseonične elektrode Enzim glukooksidaza (GOD)imobilisan je u poliakrilamidnom gelu na gas-propusnoj membrani koja pokriva elektrodu

  37. Kroz razvoj biosensora se susrećemo hronološkisa tri generacije na osnovu mehanizma dejstva: • prva generacija – senzori bazirani na kiseoničnim elektrodama • druga generacija – senzori bazirani na medijatorima i • treća generacija – elektrode sa ugrađenim enzimima

  38. Mana kiseoničnih senzoraje što su veoma skloni smetnjama od strane spoljašnjeg kiseonika Zbog toga pratimo koncentraciju proizvedenog vodonik peroksida, a ne kiseonika koji se troši u reakciji H2O2 → 2H+ + 2e- + O2 Na primenjenom potencijalu anodne oksidacije vodonik peroksida različita organska jedinjenja se oksiduju (vitamin C, mokraćna kiselina, glutation itd.) flavin-adenin-dinukleotida (FAD)

  39. Preduzeti su različiti pristupi za povećanje selektivnosti detektujuće elektrode, njenim hemijskim modifikacijama, korišćenjem: • membrana • medijatora • metalizovanjem elektroda • polimera

  40. 1.Membrane.Razvijene su različitepermiselektivne membrane, koje kontrolišu vrstekoje stižu do elektrode, na bazi naelektrisanja i veličinePrimeri obuhvatajuceluloza acetat (naelektrisanje i veličina),nafion (naelektrisanje) i polikarbonat (veličina).Nedostatakkorišćenja membranaje njihovuticaj na difuziju.

  41. 2. Medijatoridruga generacija biosenzoraMnogi oksidaza enzimimogu dakoriste veštačkeelektron akceptorske molekule, koji se nazivaju medijatoriMedijatorje niskomolekulski redoks parkoji može da prenese elektronesa aktivnog mesta enzima na površinu elektrode, i na taj način uspostavlja električni kontakt izmađu njihOvi medijatori imajuširok opseg struktura, a samimtim i osobina, uključujući iopsege redoks potencijala

  42. Kao medijatori se koriste katjoni prelaznih metala i njihovi kompleksi Jedan od boljih medijatora je ferocen(Fc) – sendvič kompleks gvožđa i dva ciklopentadienil(Cp) anjona Princip dejstva medijatora na bazi ferocena glukoza + GODOx → glukonolakton + GODR + 2H+ GODR + 2Fc+ → GODOx + 2Fc 2Fc – 2e- → 2Fc+

  43. Oksidacija glukoze se ostvaruje preko flavin-adenin-dinukleotida (FAD), komponente enzima GOD, koji se pretvara u redukovani oblik FADH2, koji se kasnije reoksiduje do FAD pomoću Fc+ (medijatora), dok se Fc reoksiduje direktno na elektrodi strujom koja će kasnije biti merena pri određivanju koncentracije glukoze

  44. Dobri medijatori bi trebalo da: • brzo reaguju sa enzimima • reverzibilno izvode transfer elektrona • imaju mali nadpotencijal pri regeneraciji • nezavisni su od pH vrednosti • stabilni su i u oksidovanom i u redukovanom obliku • ne reaguju s kiseonikom • nisu otrovni Ferocen zadovoljava sve uslove

  45. Primeri medijatora koji se obično koriste: • Ferocen (nerastvoran) • Ferocen dikarbonska kiselina (rastvoren) • Dihloro-indofenol (DCIP) • Tetrametil-fenilenediamin (TMPD) • Fericijanid • Rutenium hlorid • Metilen Plavo (MB)

  46. 3. Metalizovne elektrode Svrha korišćenjametalizovanih elektrodaje u tome da se steknu uslovi pri kojima seoksidacija enzimski generisanogH2O2može postići na nižem primenjenom potencijalu, stvarajući jako osetljivukatalitičku površinu Pored togasmanjujući efekat smetnji, zbog nižeg primenjenog potencijala,odnos signal/šum raste zabog povećanjaelektrohemijski aktivne površine

  47. Metalizacija se postižetaloženjem odgovarajućeg plemenitog metalana glas karbon elektrodu(GC), korišćenjem ciklične voltametrije Uspešni rezultatisu postignuti sa nekoliko plemenitih metala-platina, paladijum, rodijum i rubidijumod kojih se najviše može očkivati