slide1 n.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Screening & exploratie : PowerPoint Presentation
Download Presentation
Screening & exploratie :

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 39

Screening & exploratie : - PowerPoint PPT Presentation


  • 127 Views
  • Uploaded on

Screening & exploratie : sommige technieken zijn specifiek gericht op genoombanken, andere op cDNA banken, of andere kunnen op beide van toepassing zijn. - isoleren van een gen, op basis van gekende activiteit (eiwit gecodeerd door het gen) (kan via een bank, maar ook gerichter)

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about 'Screening & exploratie :' - anais


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
slide1

Screening & exploratie :

sommige technieken zijn specifiek gericht op genoombanken, andere op cDNA banken, of andere kunnen op beide van toepassing zijn.

- isoleren van een gen, op basis van gekende activiteit

(eiwit gecodeerd door het gen) (kan via een bank, maar ook gerichter)

- vergelijking van toestanden (vooral bij cDNA banken)

(welke en hoeveel mRNA's zijn ergens bij betrokken?)

- exploratie van genoombanken : uniforme representatie binnen een organisme, maar ook onderlinge vergelijking tussen organismen mogelijk

slide2

cDNA klonering : overzicht van werktuigen / strategieën / procedures / samenspel

Activiteit

extract

proteine

reverse translatie

aminozuursequentie

Antisera ( polyclonaal,

monoclonaal)

CEL

Chemische

DNA

synthesis

Tumorlijn

Natuurlijke

conditie

Sonde(s)

Inductie

Hybridisatie

mRNA

oligo-dT chromatografie

DNA sequencing

EST banken

polyA+ mRNA

in vitro translatie

cDNA

kloons

klonering

Expressie / productie

TEST

HART

HST

Activiteit

slide3

Screening van DNA banken

uitplaten van een kloonbank : als cfu/ml of pfu/ml (cellen of fagen in suspensie)

lage densiteit (individuele kloons) of hoge densiteit (tot een confluente laag)

(9 cm platen, 13 cm platen, 21 x 21 cm vierkante platen, microtiterplaten (96 - 384 - 1536)

- directe selectie : slechts zeer exceptioneel

- bvb. klonering van een antibioticum resistentiegen

- bvb. auxotrofe merkers : ‘marker rescue’ benadering : een mutante stam of

een speciaal medium/conditie is vereist (vb. isolering van het trpA gen)

- bvb. ‘complementation cloning’ : met genomische DNA fragmenten van

gist kan het defect in een E. colileuB mutant gecomplementeerd

worden => isolering van het gist LEU2 gen

- daarnaast is ook directe identificatie mogelijk : elk gen nodig voor een

biochemische conversie van een verbinding in het groeimedium tot

een visualiseerbaar product (kleur, fluorescentie, …) (vb. LacZ)

slide5

Rechtstreekse selectie van een

kloon die het R6-5 kanamycine-

resistentiegen (kanR) bevat.

Zwakke benadering als men niet vooraf

weet dat geen EcoRI knipplaats in het

kanR gen aanwezig is.

=> vandaar : via partiële splitsing zoals

voorheen gezien (hoofdstuk 8).

slide6

Directe selectie van een trpA

gen met behulp van een trpA-

stam van E. coli

Een geschikte mutante stam moet beschikbaar zijn.

(Zelfde opmerking als hiervoor

omtrent de EcoRI splitsing.)

slide7

Functionele complementatie

met DNA uit BAC kloons

in transgene muizen.

slide8

=> gen-gericht versus vergelijking-gericht

gen-gericht

- detectie van de gezochte kloon is gebaseerd op ‘informatie’ : dit kan

proteïne of nucleïnezuur (sequentie) zijn

- hybridisatie : sonde (probe) vereist

kolonie hybridisatie, kolonie ‘lifting’

plaque hybridisatie, plaque ‘lifting’

probes :(in volgorde van dalende hoeveelheid informatie)

- sequentie is bekend

- homologe sequentie beschikbaar :(een fragment volstaat)

- heterologe sequentie beschikbaar : welke temperatuur?

=> ZOO blots

- aminozuursequentie van een proteïne (geheel of deels) gekend

- synthetische/gedegenereerde sondes (oligonucleotiden)

set van individuele oligonucleotidenof mengsel of ‘guessmer’

gebruik van deoxy-inosine, enz.

- screening met PCR : DNA uit kloon pools, bij positief signaal dilueren tot

uiteindelijk een homogene kloon bekomen wordt

(de sequenties waar de primers moeten aanhechten moeten

uiteraard gekend zijn ; maar ook hier kunnen mixed primers

of degenereerde primers gebruikt worden)

slide9

Screening door hybridisatie

DNA sondes

RNA sondes

oligonucleotide sondes

"mixed probes" en guessmers

"mismatch probes“

(gedegenereerde sondes)

homologe sondes

heterologe sondes

=> "ZOO blots"

polyclonale antisera

monoclonale antilichamen

slide11

Kolonie hybridisatie.

De sonde ("probe") is radioactief

gemerkt of enzymatisch, fluorescent

of immunologisch geëtiketteerd ("tag").

Detectie door autoradiografie, kleur,

fluorescentie, enz.

Gelijkaardige procedures voor

plaque hybridisatie.

slide12

Heterologe hybridisatie

Analyse van een tarwe-

genoombank met een

cDNA kloon (voor

gliadine) als sonde.

slide14

De aminozuursequentie van gist cytochrome c.

Het hexapeptide dat geel ingekleurd is, is een

voorbeeld van hoe een nucleotidesequentie kan

voorspeld worden vanuit een aminozuursequentie.

-trp-asp-glu-asn-asn-met-

-TGG-GAY-GAR-AAY-AAY-ATG- 18-meer

2 x 2 x 2 x 2

16 oligonucleotiden vertegenwoordigen alle mogelijkheden.

Gebruik van synthetische

oligonucleotiden.

Terugkoppeling naar de

degeneratie van de

genetische code.

slide15

Gebruik van een synthetisch,

gemerkt of geëtiketteerd

oligonucleotide (of mengsel

van alle mogelijke sequenties) om

een kloon van het cytochroom c

gen van gist te identificeren.

=> twee hybridisatierondes :

van waarschijnlijk tot definitief.

slide16

Kodewoordgebruik

frequenties per duizend (absoluut aantal)

(hulpmiddel bij uittekenen van een

guessmer ; uiteraard de tabel

nemen van het organisme waarvan

de insert-DNAs afkomstig zijn.)

in E. coli O157:H7 EDL933

5347 CDS's (1611503 codons)

in E. coli K12

14 CDS's (5122 codons)

UUU 22.2 (35846) UCU 8.7 (14013) UAU 16.5 (26648) UGU 5.2 ( 8458)

UUC 15.9 (25565) UCC 8.9 (14420) UAC 12.3 (19766) UGC 6.4 (10285)

UUA 13.8 (22316) UCA 8.1 (13117) UAA 2.0 ( 3163) UGA 1.1 ( 1751)

UUG 13.0 (20904) UCG 8.8 (14220) UAG 0.3 ( 435) UGG 15.3 (24656)

CUU 11.4 (18366) CCU 7.2 (11657) CAU 12.8 (20631) CGU 20.2 (32590)

CUC 10.5 (16869) CCC 5.6 ( 8961) CAC 9.4 (15116) CGC 20.8 (33547)

CUA 3.9 ( 6257) CCA 8.4 (13507) CAA 14.7 (23703) CGA 3.8 ( 6166)

CUG 51.1 (82300) CCG 22.4 (36178) CAG 29.4 (47324) CGG 6.2 ( 9955)

AUU 29.7 (47838) ACU 9.1 (14639) AAU 19.2 (30864) AGU 9.4 (15123)

AUC 23.9 (38504) ACC 22.8 (36724) AAC 21.7 (34907) AGC 16.0 (25800)

AUA 5.5 ( 8835) ACA 8.1 (13030) AAA 34.0 (54723) AGA 2.9 ( 4656)

AUG 27.2 (43846) ACG 15.0 (24122) AAG 11.0 (17729) AGG 1.8 ( 2915)

GUU 18.1 (29200) GCU 15.4 (24855) GAU 32.8 (52914) GGU 24.2 (38983)

GUC 14.8 (23870) GCC 25.2 (40571) GAC 19.2 (30953) GGC 28.1 (45226)

GUA 10.9 (17561) GCA 20.7 (33343) GAA 39.3 (63339) GGA 8.9 (14286)

GUG 26.2 (42261) GCG 32.3 (52091) GAG 18.7 (30158) GGG 11.8 (18947)

UUU 19.7 (101) UCU 5.7 ( 29) UAU 16.8 ( 86) UGU 5.9 ( 30)

UUC 15.0 ( 77) UCC 5.5 ( 28) UAC 14.6 ( 75) UGC 8.0 ( 41)

UUA 15.2 ( 78) UCA 7.8 ( 40) UAA 1.8 ( 9) UGA 1.0 ( 5)

UUG 11.9 ( 61) UCG 8.0 ( 41) UAG 0.0 ( 0) UGG 10.7 ( 55)

CUU 11.9 ( 61) CCU 8.4 ( 43) CAU 15.8 ( 81) CGU 21.1 (108)

CUC 10.5 ( 54) CCC 6.4 ( 33) CAC 13.1 ( 67) CGC 26.0 (133)

CUA 5.3 ( 27) CCA 6.6 ( 34) CAA 12.1 ( 62) CGA 4.3 ( 22)

CUG 46.9 (240) CCG 26.7 (137) CAG 27.7 (142) CGG 4.1 ( 21)

AUU 30.5 (156) ACU 8.0 ( 41) AAU 21.9 (112) AGU 7.2 ( 37)

AUC 18.2 ( 93) ACC 22.8 (117) AAC 24.4 (125) AGC 16.6 ( 85)

AUA 3.7 ( 19) ACA 6.4 ( 33) AAA 33.2 (170) AGA 1.4 ( 7)

AUG 24.8 (127) ACG 11.5 ( 59) AAG 12.1 ( 62) AGG 1.6 ( 8)

GUU 16.8 ( 86) GCU 10.7 ( 55) GAU 37.9 (194) GGU 21.3 (109)

GUC 11.7 ( 60) GCC 31.6 (162) GAC 20.5 (105) GGC 33.4 (171)

GUA 11.5 ( 59) GCA 21.1 (108) GAA 43.7 (224) GGA 9.2 ( 47)

GUG 26.4 (135) GCG 38.5 (197) GAG 18.4 ( 94) GGG 8.6 ( 44)

slide17

Vergelijking van kodewoordgebruik in E. coli genen met hoog of laag expressieniveau

*

"strong" : 24 genen (5253 triplets), waaronder 12 voor ribosomale eiwitten, 7 voor buitenmembraaneiwitten

en een aantal voor RNA polymerase en translatie-initiatie- en terminatiefactoren.

"weak" : 18 genen (5231 triplets), voor o.a. verschillende repressoreiwitten, lac-permease (LacY), e.a.

slide18

*

Antibodies :

(a) Antilichamen binden aan

"vreemde" moleculen en

helpen bij hun afbraak.

(b) Gezuiverde antilichamen

("antisera") kunnen bekomen

worden (o.a.) uit een kleine

hoeveelheid bloed van een

konijn dat geïnjecteerd was

met het "vreemde" proteïne.

slide19

- immunochemische methoden : rechtstreeks op expressie product (epitoop)

(dit kan matuur proteïne of fusieconstruct zijn)

=> binding aan polyvinylplaten (kolonies)

of aan cellulosenitraat membranen (l-plaques)

=> oorspronkelijk met 125I-gemerkte IgG als sonde

ook met gemerkt proteïne A (een Staphylococcus aureus eiwit dat bindt aan IgG’s van heel wat zoogdieren)

=> nu, vaker enzymatische merking van het antilichaam (vb. alkalische fosfatase)

primair antilichaam tegen het doelwit, secundair (gemerkt) antilichaam

om het gebonden primair antilichaam te detecteren

=> gebruik van ofwel polyklonale antilichamen of monoclonaal antilichaam

slide20

Immunoscreening

Detectie door :

- het gemerkte antilichaam zelf

of

- gemerkt proteïne A

(zoals in deze figuur)

of

- gebruik van een tweede

antilichaam dat specifiek bindt

aan het primaire antilichaam.

slide21

Plaque screening van kloons

van fusieproteïnen (aan LacZ)

met behulp van antilichamen.

"Sandwich"-benadering bij analyse met antilichamen als sonde.

slide22

Activiteit

extract

proteine

reverse translatie

aminozuursequentie

Antisera ( polyclonaal,

monoclonaal)

CEL

Chemische

DNA

synthesis

Tumorlijn

Natuurlijke

conditie

Sonde(s)

Inductie

Hybridisatie

mRNA

oligo-dT chromatografie

DNA sequencing

EST banken

polyA+ mRNA

in vitro translatie

cDNA

kloons

klonering

Expressie / productie

TEST

HART

HST

Activiteit

slide23

Wat indien geen (enkele) informatie beschikbaar is?

- indirecte benaderingen : louter gebaseerd op “activiteit”

(translatie in vitro tot actief eiwit)

- HArT (‘hybrid arrested translation’)

- in vitro translatie van mRNA extract

=> selectieve inhibitie van translatie door complementair DNA

- HST (HRT) (‘hybrid-selected translation’, ‘hybrid-released translation’)

- affiniteitsselectie en her-elutie van de ‘positieve’ activiteit

=> pools van clones, stapsgewijs reduceren tot enkelvoudige kloons

slide24

mRNA extract analyse voeg gedenatureerd plasmide DNA analyse

activiteit toe van 1 of meer cDNA kloons activiteit

in vitro translatie

proteïne biochemische in vitro translation

test proteïne test

Wat indien geen (enkele) informatie beschikbaar is?

Hybrid arrested translation (HArT)

Het plasmide DNA van de cDNA kloon die de biologische activiteit inhibeert in de

biochemische test is een goede kandidaat-positieve kloon.

Pools van DNAs worden simultaan getest, en vervolgens opgesplitst in kleinere

aantallen, totdat individuele kloon DNAs kunnen getest en geanalyseerd worden.

=> Het negatieve signaal (door inhibitie) wijst op een positieve kloon.

slide25

Hybrid selection translation (HST)

mRNA wordt geselecteerd uit een totaal

mRNA extract door hybridisatie op een

geïmmobiliseerd cDNA plasmide kloon

DNA.

In vitro translatie van het geselecteerde

mRNA (na elutie) geeft proteïneproduct

dat in de biochemische test geanalyseerd

wordt.

Een positief signaal wijst naar de

gewenste kloon.

slide26

=> gen-gericht versus vergelijking-gericht

vergelijking-gericht

- ‘abundance screening’ : bij klonering zal grosso modo de hoeveelheid DNA

van elk insert geëgaliseerd, zelf al was het mRNA in de

oorspronkellijke cel slechts minimaal aanwezig ;

maar : het aantal kloons van een mRNA komt nu overeen met de relatieve

concentratie van een mRNA in de populatie

- in genoombanken : genfamilies

- in cDNA banken : hoge versus lage abundantie van mRNA’s

- differentiële expressie en ‘difference screening’ : enkele voorbeelden

- Xenopus laevis gastrula versus egg mRNA

- vergelijking tussen blad – wortel – stam – enz. bij planten

- planten in licht of in ‘t donker

- + / - inductie

- substractieve technieken (screening/klonering)

- mRNA en cDNA zijn steeds complementair :

er is dus geen complementariteit tussen mRNA's van verschillende oorsprong

er is dus geen complementariteit tussen cDNA's van verschillende oorsprong

- sondes met positieve (na substractie) of negatieve (vergelijking) identificatie

slide27

"Difference screening"

&

"differential expression analysis"

“Abundance screening” :

Hybridisatie met sondes uit een cDNA bank om

de abundante genen (of mRNAs) te identificeren.

*

Meerdere DNA-filters worden in parallel gemaakt en vergeleken na hybridisatie met verschillende sondes.

Gemerkte of geëtiketteerde cDNA copies van mRNA populaties van verschillende soorten cellen of celtypes, of na groei onder diverse condities, of na inductie of andere behandelingen.

slide28

Substractieve technieken : vergelijking van celtypes

mRNA bereid uit celtype A.

mRNA bereid uit celtype B.

cDNA bereid op mRNA van celtype A,

enkelstrengig na alkalische behandeling.

Het cDNA is complementair aan het

mRNA, ook deze van celtype B voor

zover deze in celtype B tot expressie

komen.

=> renaturatie van cDNA(A) met

mRNA(B) geeft hybriden, maar

sequenties die beide celtypes niet

gemeenschappelijk hebben blijven

enkelstrengig.

mRNA en RNA-DNA hybriden binden

aan hydroxyapatiet (d.i. Ca5(PO4)3(OH)).

Celtype A-specifiek cDNA kan worden

geïsoleerd en gebruikt hetzij om een

A-specifieke cDNA bank aan te maken,

hetzij om als sonde gebruik te worden

om een volledige cDNA bank van

celtype A te screenen.

slide29

Vergelijking van cellen voor en na inductie.

Stappen in differentiële hybridisatie screening procedures.

+/- strategie : vergelijking van

signalen bekomen met replica

filters, na hybridisatie met

materiaal afgeleid van cellen in respectievelijk een geïnduceerd

en niet-geïnduceerd stadium.

Stippellijnen : strategie met

"gesubstracteerde" sondes, aangerijkt in sequenties die

specifiek onder inductie-

omstandigheden aanwezig zijn.

Directe identificatie van de

"positieve" kloons.

slide30

vergelijking-gericht(vervolg)

- ‘differential display’ (PCR benadering)

- cDNA-synthese start met een oligonucleotide zoals

5’-TTTTTTTTVN-3’ (1 van 12)

- terugpriming met nonameren (of hexameren or decameren)

- amplicatie door “toeval” :

=> uitfiltering tot detecteerbaar aantal signalen na gelfractionatie

=> verschillen vereisen nauwkeurige bevestiging

- ESTs : random DNA sequencing van kloons uit de bank : 300-600 nt als etiket

(‘expressed sequence tag’)

- systematische sequentieanalyse van cDNA kloons (inserts)

- oriëntatie-"probleem"

- uitsortering (contig-vorming)

- voordeel : routinematig karakter ; relatieve eenvoud

- nadeel : werkintensief en duur door de grootschaligheid

enigszins overmatig t.o.v. van de gewonnen informatie

- EST-banken eerder globaal per organisme dan per conditie

N

N

slide32

vergelijking-gericht(vervolg)

- RDA (‘representational difference analysis’)

- genoom vergelijking

- cDNA vergelijking

=> selectieve amplificeerbaarheid verwezenlijken van hetgeen niet

gemeenschappelijk is door manipulatie van de fragmentuiteinden.

=> 'tester' (doelwit) en 'driver' (het selecterende agens : in overmaat)

=> alleen de unieke testerfragmenten hebben een PCR-primersequentie aan beide uiteinden

- SAGE : aaneenschakelen van korte etiketten (9-20 bp), één etiket per mRNA

(“serial analysis of gene expression”)

representatie van de mRNA-moleculen door een kort etiket ('tag')

=> er zijn meer dan 260.000 nonameer-etiketten

> < er zijn maximaal slechts een paar tienduizend mRNA's

- etiket => moet voldoende lang zijn om selectief (en informatief) te zijn

=> moet voldoende kort zijn om aantal sequentieanalyses

te beperken door concatenatie van de etiketten

- nadeel : heel wat manipulaties om een 'tag library' aan te maken

- voordeel : zeer kwantitatieve analyses zijn mogelijk

(tienduizenden tags zijn haalbaar ; frequentiemeting door telling)

- initëel : op basis van FokI : etiket 9 + 4

- verdere ontwikkeling naar grotere etiketten => long-SAGE

- balans tussen (meer) informatie en (meer) sequentieanalyses

slide33

RDA

uit : Primrose & Twyman

slide34

RDA : aanmaak van tester en driver DNA

Restrictiesplitsing van cDNA staal

(gemiddelde grootte van fragmenten >200 bp)

"Anneal " en ligeer een 12/24 linker cassette

(bovenste streng alleen aan linkerzijde

onderste streng alleen aan rechterzijde)

Verwijder het 12-meer en vul in tot even uiteinden

PCR amplificatie geeft een grote hoeveelheid aan tester en driver DNA

(synthetische) linkers zijn niet gefosforyleerd

slide35

RDA

TesterDriver

Verwijder de eerste adaptor door restrictiesplitsing

Koppel een tweede adaptor (zoals de eerste) maar alleen aan het tester DNA

Meng tester en driver in a 1/100 verhouding. Denatureer en re-associeer.

Invulreactie met DNA polymerase

Tester / Driver

lineaire amplificatie

Tester / Tester

exponentiële amplificatie

Driver / Driver

geen amplificatie

PCR amplificatie met de primers die overeenkomen met de tweede adaptor (of gedeelte ervan)

Karakteriseer de amplificatieproducten

slide36

Schematische voorstelling

van de SAGE methode :

1) specifieke tag voor elk mRNA

2) concatenatie voor identificatie

door sequentieanalyse

3) optellen van frequentie van

voorkomen

Tel voor elke tag

het aantal keer

dat hij voorkomt

in de sequenties.

slide37

Algemene basis van SAGE.

'Anchoring' enzym : NlaIII

'Tagging' enzym : FokI

(zie details op volgende slide)

slide38

Elk mRNA is vertegenwoordigd

door één tag : deze ligt, kijkend

vanaf de poly(A) staart, bij het

eerste voorkomen van een NlaIII

knipplaats.

FokI splitst op posities 9/13 : het

4-nt uiteinde wordt ingevuld

door DNA polymerase.

(het 14/18 fragment komt los van de

parels en wordt nu ingevuld tot 18-bp

even fragmenten ; exclusief de primer

sequentie voor de FokI plaats)

Ligatie (van even uiteinden)

koppelt twee 18-bp fragmenten

tot 36-bp en splitsing met

NlaIII reduceert deze tot 18-bp

met extra 3'-CATG-uiteinden

aan beide zijden.

De tags worden paarsgewijs

geligeerd in de vector. De

paren zijn bijgevolg gescheiden

door een CATG (en kunnen

aldus geïdentificeerd worden).

slide39

*

Voorbeeld van een SAGE tag analyse in gist (S. cerevisiae)