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实验八 核酸的定量测定 ——定磷法 Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic P hosph ate Assay

实验八 核酸的定量测定 ——定磷法 Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic P hosph ate Assay. 一、实验原理 核酸分子中含有一定比例的磷，一般为9.5%左右，若 测得某一核酸样品中磷的含量，即可推算其核酸的含量。 用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，无机磷 再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。. PO 4 3- + 3NH 4 + + 12MoO 4 2- + 24H +

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实验八 核酸的定量测定 ——定磷法 Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic P hosph ate Assay

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  1. 实验八 核酸的定量测定——定磷法Exp.8 Determination of Nucleic Acid by Inorganic Phosphate Assay

  2. 一、实验原理 • 核酸分子中含有一定比例的磷，一般为9.5%左右，若 • 测得某一核酸样品中磷的含量，即可推算其核酸的含量。 • 用强酸使核酸分子中的有机磷消化成无机磷，无机磷 • 再与钼酸铵结合成磷钼酸铵。 PO43- + 3NH4+ + 12MoO42- + 24H+ (NH4)3PO4·12MoO3·6H2O↓(黄色)+6H2O

  3. 当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再当有还原剂存在时，Mo6+被还原成Mo4+，此4价钼再 • 与试剂中的其它MoO42－结合成Mo(MoO4)2或Mo3O8呈兰 • 色，称为钼兰。 • (NH4)3PO4·12MoO3·6H2O↓ • 还原剂（抗坏血酸） • 钼兰Mo(MoO4)2或Mo2O8 • 在一定浓度范围内，兰色的深浅和磷酸的含量成正 • 比，可用比色法测定其光吸收值。 • 样品中若有无机磷，应将无机磷扣除，否则，测定结 • 果偏高。

  4. 二、实验用品 • 1、材料 • 粗核酸（酵母核糖核酸，含磷量大于7%） • 2、试剂 • (1) 6 mol/L H2SO4溶液 • （2）10 mol/L H2SO4溶液 • （3）2.5%钼酸铵溶液 • （4）10%抗坏血酸溶液 • (5) 定磷试剂 • 在使用前将上述试剂按以下比例混合,蒸馏水：6N H2SO4：2.5%钼酸铵：10%抗坏血酸=2：1：1：1（V/V）。

  5. （6）标准无机磷储备液（含磷量1mg/1ml） • 将磷酸二氢钾（A·R）于110℃烘至恒重（一般需4小时以上），然后置于干燥器内冷却。用分析天平精确称取1.0967克，定溶至250ml。此液为储备液，放入冰箱内保存，用时再稀释。

  6. 3、仪器设备 • 恒温水箱 分光光度计 • 三、方法和步骤 • 1、标准曲线的制作 • 精确吸取0.5 ml标准无机磷储备液， 于50 ml容量瓶中 • ，用蒸馏水稀释至刻度，配制成含磷量为10 ug/1ml的标 • 准无机磷溶液。 • 取6支试管，按下表编号，分别按表内要求，加入标准磷溶液蒸馏水及定磷试剂。加毕，摇匀，于45℃水浴保温10分钟，冷却，用721型分光光度计分别测定其光吸收值（A660nm）。

  7. 表1.无机磷标准曲线的绘制

  8. 2、总磷的测定 • 准确称取样品（如粗核酸）0.1克，用少量水溶解，（如不溶，可滴加5%氨水调至pH7.0），转移至50ml凯氏烧瓶中,加水至刻度。吸取上面的样品液1.0mL，置于50ml凯氏烧瓶中，加入2.5毫升10mol/L H2SO4，将凯氏烧瓶接在凯氏消化架上（或在通风橱内），在电炉上加热，至溶液透明，表示消化完成。冷却，将消化液移入100ml容量瓶中，用少量蒸馏水洗涤凯氏烧瓶两次，洗涤液一并倒入容量瓶，再加水至刻度。 • 混匀后，吸取3.0ml置于试管中，加定磷试剂3.0 ml，摇匀，45℃保温10分钟，冷却。测其A660nm。

  9. 3、无机磷的测定 • 吸取样品液（2mg/1ml）1.0 ml，置于100 ml容量瓶中 • ，加水至刻度，摇匀后，吸取3.0 ml置于试管中，加定试 • 剂3.0 ml，45℃水浴保温10分钟，冷却，测其光吸收值。 表2 总磷和无机磷的测定

  10. 四、实验结果 • 总磷A660nm－无机磷A660nm= 有机磷A660nm • 由标准曲线查得有机磷微克数（X）。按下试计算样品中核酸百分含量。 • ( X / 测定时取样的ml数 ) ×稀释倍数 × 11 • 核酸% = —————————————————×100% • 样品重量(g)

  11. 五、思考题1．指出测定核酸含量的几种方法，并进行比较各自的优缺点？2．除了样品溶液消化至透明，表示消化完成外，还可以用何种方法来分析判断？五、思考题1．指出测定核酸含量的几种方法，并进行比较各自的优缺点？2．除了样品溶液消化至透明，表示消化完成外，还可以用何种方法来分析判断？

  12. 六、参考文献 • 1.现代生物学基础实验指导,林宏辉等,四川大学出版社,2003 • 2.生物化学实验原理和方法,李建武等编,北京大学出版社 1994年 • 3.The tools of Biochemistry,Terrance G,Cooper,1977 • 4.生物化学实验,陈钧辉等编,3版或4版 科学出版社2003

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