„ Scaffold ” -ok előállítása

1. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011

2. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 9. Előadás „Scaffold”-ok előállítása

3. „Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok I. Biokompatibilitás– immunreakciók elkerülése Felszíni kémia– sejtfunkciók támogatása Egymással összeköttetésben lévő pórusok kialakítása– sejtek egyenletes eloszlásának és erek képződésének támogatása Ellenőrzött biodegradáció– az új szövet kialakulásának lehetővé tétele

4. „Scaffold” előállítás - Alapvető kritériumok II. Mechanikai tulajdonságok– a szerkezet és funkció stabilitása a beültetés után illetve a szöveti újraképződés során Lehetőség különböző gyógyszermolekulák illetve bioaktív anyagok beágyazására és szabályozott felszabadulására ECM interakció– beültetés után az ECM kialakulásának támogatása Beültetés után az ECM helyettesítése

5. A „scaffold”-ok tulajdonságainak jelentősége Biztosítják a sejtek számára a 3D környezetet Beültetés után átmenetileg az ECM-t helyettesíti Közvetlenül irányítják a sejtek differenciálódását Szerkezetük meghatározza az előállított szövetkonstrukciók tápanyagellátását

6. Öntéses-kioldásos módszer(SCPL)I. • Az oldószerben feloldott „scaffold”-anyagot pórusképző részecskékkel töltött öntőformába öntik • Oldószer elpárologtatása • Pórusképző részecskék kioldása • „Scaffold” bevonat: az öntőformát a feloldott „scaffold” anyagba mártják • Egyszerű, könnyű, olcsó technika • Nem igényel speciális laboratóriumi felszerelést • A használt szerves oldószerek gyakran mérgezőek, maradványaik nehezen eltávolíthatóak

7. Öntéses-kioldásos módszer (SCPL)II. Oldószer Öntőforma Porogén Polimer Oldószer elpárologtatása Porózus szerkezetet kapunk Porogén kioldása

8. Fázis szeparációs módszerek A polimert két, egymással nem elegyedő oldószer keverékében oldják fel A telített oldatot melegítik A magas illetve alacsony polimer-tartalmú fázisok elkülönülnek egymástól A hőmérséklet csökkentésével a polimer kiválik a fázishatáron a túltelített oldatokból Az oldószert eltávolítják (kivonás, elpárologtatás, szublimáció)

9. MagasszintűtechnikákGázhabosítás • Speciális felszerelést igényel • A „scaffold” anyagát nyomásálló kamrába töltik • A „scaffold” anyagát szuperkritikus állapotú széndioxidban „oldják” fel • A hőmérséklet csökkentésével gáz halmazállapotúvá válik • A fázishatáron kicsapódik a feloldott polimer 10 000 szilárd szuperkritikus állapot 1 000 folyadék Nyomás P (bar) 100 kritikus pont 10 gáz hármas pont 1 200 250 300 350 400 Hőmérséklet T (K)

10. ElektroszövésI. Injektor Polimervagy kompozit oldat Fémtű Magasfeszültségű áramforrás Elektromosan töltött szál V Gyűjtőlemez

11. ElektroszövésII. Speciális felszerelést igényel Sokoldalú, flexibilis technika Nincs szükség extrém körülményekre (hő, koaguláció) Többféle polimer használható, pl.: PLA, PLGA, selyem fibroin, chitosan, kollagén Szálvastagság, pórusméret, szálorientációkönnyedén szabályozható

12. MagasszintűtechnikákSzövött biotextíliák Speciális felszereltséget igényel Az így előállított „scaffold”szabályos, szövött szálakat tartalmaz 2D illetve 3D „scaffold” szerkezet is előállítható A pórusméret könnyen szabályozható Sokoldalú technika, a „scaffold”anyag széles körben alkalmazható és kombinálható

13. Szövött biotextília

14. MagasszintűtechnikákSpontán „összeszerelődés” Spontán „összeszerelődés”a molekulák spontán összeállása rendezett struktúrává Oldott állapotban az amfofil peptidek nem-kovalens kötésekkel összekapcsolódnak

15. Amfofilpeptidek tervezése Foszfoszerin-csoport serkenti a mineralizációt (csontszövet előállításánál) RGD motívumok segítik az adhéziót (integrin-kötőhelyek biztosítása) Ciszteinek a molekulák közötti keresztkötések létrejöttét teszik lehetővé GGG összekötő-motívumok a feji és farki rész között növelik a molekuláris szerkezet rugalmasságát

16. MagasszintűtechnikákAutomatikus gyártási technológiák „Rapid prototyping”: adott szerkezetű tárgy automatizált előállításaadditívtechnológia felhasználásával Gyors technológia, mely azonos minőségű, szerkezetű, mintázatú „scaffold”-ot eredményez Drága módszer, számítógép vezérelt készüléket igényel

17. MagasszintűtechnikákFused deposition modeling (FDM) • Robotikusan vezérelt készülék • Polimer vagy más anyagból készült szálat tesz le a lerakófejen keresztül több rétegben • Szilárd felületre vagy • „Vonalkázva”: ekkor a később eltávolításra kerülő részekhez más anyagot használnak

18. A kicsivel az olvadáspontja alatt tartott, por vagy granulátum formájú „scaffold” anyagból egy réteget terítenek le (előreprogramozott minta szerint) A számítógép-vezérelt lézersugárfelmelegíti az anyagot, amely ennek hatására összeáll (összeolvad anélkül, hogy megolvadna) Újabb réteget fektetnek le és olvasztanak össze A tárgy 3D szerkezete így rétegenként épül fel MagasszintűtechnikákSelective laser sintering (SLS)

19. Selectivelasersintering(SLS) 1 2 3 „Scaffold” anyagot mozgató rendszer Szkenner Lézer „Scaffold” réteg Éppen készülő tárgy Roller 4 5 7 Dugattyú Dugattyú Dugattyú 6

20. Az orvosi biotechnológiai mesterképzés megfeleltetéseaz Európai Unió új társadalmi kihívásainaka Pécsi Tudományegyetemen és a Debreceni Egyetemen Azonosító szám: TÁMOP-4.1.2-08/1/A-2009-0011 Dr. Pongrácz Judit Háromdimenziós szövettenyésztés és „tissueengineering” – 10. Előadás Biokompatibilitás

21. Biokompatibilitás - Definíció • Az anyag azon képessége, hogy a befogadó szervezetben az alkalmazásának megfelelő választ vált ki. • A biokompatibilitása TE termékek előállításához használt „scaffoldok” vagy mátrixok azon képessége, hogy olyan szubsztrátként viselkednek, amely támogatja a megfelelő sejtműködést, vagyis megkönnyíti a molekuláris és mechanikai jelátviteli rendszerek működését az optimális szövetregeneráció érdekében, DE sem az adott sejtekben, sem pedig lokálisan vagy szisztémásan nem idéz elő nem kívánt válaszreakciót.

22. Biokompatibilitás - Jelenlegi nézetek • Régi koncepció:olyan bioanyagok használata, melyek nem lépnek interakcióba a befogadó szervezet („host”)szöveteivel • A bioanyag-tervezés új célkitűzései: • A bioanyagok aktív módon interakcióba lépnek a „host” szöveteivel • Pozitív élettani választ váltanak ki • Támogatják a sejtek növekedését és differenciálódását

23. Bioanyagok biokompatibilitása • A természetből származó anyagok természetüknél fogva biokompatibilisek(pl.:kollagén, fibrin, hyaluronsav) • A xenogén bioanyagokat a biokompatibilitás eléréséhez módosítani kell (pl.: borjúkollagén humán felhasználása előtt az immunogén szekvenciákat el kell távolítani emésztéssel) • Már rekombináns humán kollagén is kapható • Más xenogén anyagok (pl.: növényi eredetű poliszacharidok) biokompatibilitását tesztelni kell • Szintetikus anyagoknál szintén ellenőrizni kell azok biokompatibilitását

24. Biokompatibilitás - Terminológia • Biodegradálhatóság: in vivo makromolekulárisdegradáció; a lebomlási termékek nem eliminálódnak a szervezetből • Bioabszorbeálhatóság: a makromolekuláriskomponensek az anyagcsere megváltozása nélkül jutnak be a szervezetbe • Biológiaifelszívódóképesség: a makromolekuláris alkotóelemek lebomlása és metabolizálódása, a molelulatömeg csökkenése, a végtermék kiválasztása

25. Biokompatibilitástesztelése • A vér/anyagvagyszövet/anyaghatárfelületnek a lehető legkisebbnek kell lennie • Álljon ellen a biodegenerációnak • Fontos, hogy a bioanyag természetes anyagként viselkedjen vér és szövet jelenlétében. • A beültethetőséget kizárja, ha az anyag: • Vérrögképződést indít el (Trombózisveszély) • Károsítja vagy szenzitizálja a vér sejtes elemeit • Megváltoztatja vérplazma fehérjéit (köztük enzimeket) nem kívánt reakciókat előidézve • Káros immunreakciót indít el • Rákot okoz • Teratogén • Toxikus vagy allergiás választ vált ki • Elektrolitvesztést okoz • Sterilizálás hatással van rá

26. Inkompatibilitás miatt fellépő komplikációk • A beültetett anyag elleni immunreakció • Krónikus gyulladás • Hegszövet képződés • Fokozott véralvadás (érgraft inkompatibilitás) • Graft elégtelenség • Kilökődés

27. Normál sebgyógyulás A sebgyógyulás több fázisra osztható, az egyes szakaszokra a bennük szerepet játszó sejtpopulációk illetve sejtfunkciók egyaránt jellemzőek: • Véralvadás • Gyulladás • Sejtek inváziója és szöveti újraképződés

28. Idegentest reakció I. Az implantátum jelenléte megváltoztatja a gyógyulási folyamatot, ez az un. idegentest reakció(Foreign Body Reaction, FBR), részei: • Fehérje adszorpció • Makrofágok • Sokmagvú idegentest óriássejtek • Fibroblasztok • Érképződés Az implantátum folyamatos jelenléte egy végső készenléti állapot eléréséhez vezethet (resolution). Az implantátum sorsa ezután a következő 3 folyamat egyike lehet: • Reszorpció • Integráció • Enkapszuláció (fibrózis)

29. Idegentest reakció II. Ér Endotél Az abszorbeált plazmafehérjék granulocita és makrofág választ indítanak el A frusztrált fagocitózis a makrofágok aktivációjához és óriássejtek képződéséhez vezet Monociták Sejt-vándorlás Idegentest típusú óriássejtek Makrofágok Fibroblasztokat és kollagént tartalmazó réteg Makrofágokat tartalmazó réteg Bioanyag Bioanyag

30. Bioanyagok • Ideiglenes implantátumok: • A szöveti regeneráció és gyógyulás átmeneti segítése • Csont graftok, biológiailag felszívódó sebészeti varratok • Állandó implantátumok: • Hosszú távú fizikai integritás és mechanikai teljesítmény • Szervműködés hosszú távú helyettesítése • Műbillentyűk, ízületek, stb.

31. Biológiailaginert anyagok • Poli-tetrafluor-etilén (PTFE, Teflon®): • A szervezet számára inert • Rendkívül alacsony súrlódási együttható (0,05-0,10 a polírozott acélhoz képest) • Biológiailag inert, az élő szövetekkel nem lép interakcióba • Ízületi protézisek valamint műbillentyűk felszínének borítására használják

32. Szilikon származékok • A szilikonok olyan polimerek, amelyek a biokompatibilis polimerek által általánosan tartalmazott C, H, N, O elemek mellett Si-t is tartalmaznak • A szilikonok gyógyászati osztályozása: nem beültethető, rövid- illetve hosszútávra beültethető szilikonok • Katéterek, csövek, mellimplantátumok, óvszerek előállításához

33. Biokompatibilis fémek • Titánium ötvözetek ízületi protézisekhez és fogpótlásokhoz • Kitűnő mechanikai sajátságok • Nem toxikusak, és nem lökődnek ki • Egyedülálló osseointegrációs képesség • A beültetést megelőzően alkalmazott hidroxiapatit borításelősegíti az osseointegrációt

34. Hidroxiapatit kerámiák • A hidroxiapatit (HA) természetes állapotban a csontokban és a fogakban megtalálható • HA kristályokat gyakran más polimerekkel kombinálják a „scaffold” előállítás során • Mikrokristályos HAtáplálékkiegészítőként is kapható a csontritkulás megelőzésére • Jobb, mint a CaCO3az oszteoporózis megelőzésében

35. Poli-a-hidroxi-savak:bioabszorbeálhatópolimerek • Leggyakrabban használt bioanyagok • Fő felhasználási terület: felszívódó varratok, gyógyszerhordozó „scaffold”-ok, ortopédiai protézisek • Poliészter láncok • Egyszerű hidrolízissel történő biodegradáció • A keletkező a-hidroxi-savak különböző anyagcsereutakon át eliminálódnak (pl.: citromsav ciklus) vagy módosítás nélkül a vizelettel távoznak

36. Poli-a-hidroxi-savak biodegradációjaI. • Leggyakrabban használt poli-a-hidroxi-savak: • Poli-tejsav (PLA) • Poli-glikolsav (PGA) • Poli-kaprolakton (PCL) • Degradációs termékeik a citrátkörbe lépnek be H2O + (CH2)nCO(CH2)n C HO(CH2)n CO (CH2)COH O O O O Poliészter Hidroxi-terminális Karboxi-terminális

37. Poli-a-hidroxi-savakbiodegradációjaII. H2O Észteráz PHB b-Hidroxi-butirát Szerin Glicin Glikolsav PGA H2O PDS Piruvát Tejsav PLA CO2 H2O Acetoacetát Acetil-KoA PGA = poli-(glikolsav) PLA = poli-(tejsav) PDS = poli-(d-dioxán) PHB = poli-(hidoroxi-butirát) Vizelet Citromsav CO2 Citrátkör H2O Oxidatív foszforiláció ATP

38. Poli-a-hidroxi-savak felhasználása

39. Poli-(Glikolsav), (PGA) • PGA merev, erősen kristályos anyag • Kizárólag erősen apoláros szerves oldószerekben oldódik • Főként felszívódó varratokban használják (Dexon®) • SCPL technikával „scaffold” előállítás • Tömeg-degradáció • Természetes lebomlási termék (glikolsav)

40. Poli-(tejsav), PLA és PGA kopolimerek • D, L izoformák ésracémek keverékei • Leggyakrabbab az L izoformát használják együtt PGA-val:PLGA kopolimer • PLGA egyike azon kevés polimernek, amelyet humán felhasználásra fejlesztettek ki • PGA és PLLA kopolimerjei széles körben felhasználhatóak • A degradáció sebessége illetve típusa a kopolimer összetételétől függ

41. Politejsavakbiodegradációja • Általános lépés az észterkötések random hidrolízise • A degradáció típusa és sebessége az összetételtől függ • A lebomlási termékek nem toxikusak, nem váltanak ki gyulladást • Nagyméretű ortopédprotézisek esetén azok savas degradációja toxikus termékeket eredményezhet • Kisebb darabok törhetnek le az implantátumról, melyek gyulladást okozhatnak

42. Poli-(kaprolakton), (PCL) • Szemikristályos polimer • Nagyon lassú degradáció (a tiszta PCL 3 év alatt bomlik le, más kapronokkal alkotott kopolimerjei könnyebben degradálódnak) • Hosszabb távú gyógyszerhordozásra használják • A PCL-tbiokompatibilis, nem toxikus anyagként tartják számon

43. Polimer erózió • A víz beszivárog az anyagba, a polimer amorf fázisának kémiai kötéseit hasítja, így a hosszú polimerláncokat rövid vízoldékony darabokra bontja. • Ennek következtében a molekulatömeg csökken, a fizikai tulajdonságok viszont nem változnak, hiszen a kristályos fázisok összetartják a polimert. A víz átjárja az anyagot, és a fragmensekmetabolizálódását és tömegerózióját indítja el. • A polimer felületi eróziójáról akkor beszélünk, ha a polimer gyorsabban alakul át vízoldékony anyagokká, mint ahogy a víz beszivárog a konstrukcióba.

44. Bioanyagok degradációjának típusai Felületi erózió Tömegerózió Degradáció Idő

45. DegradációI. • Biológiailag lebomló hidrogélek: a vízoldékonypolimerláncok közötti kémiai keresztkötések hasítása • Felületi erózió a jellemző • A tömegveszteség lineáris a degradáció során

46. Degradáció II. CH3 CH3 CH3 • A polimerlánc hasítása vízoldékony monomereket eredményez O O O O O O H2O −HO − CH − C − OH +OH − CH2 − C − OH −(CH − C − O − CH − C − O −)x−(CH2− C − O − CH2 − C − O)y− Krebbsciklus CO2 + H2O

47. DegradációIII. • Polimerhidrofóbicitás: a hidrofóbicitásnövekedése nagyobb stabilitást eredményez • Bulkyszubsztitúciós csoportok (pl.:metil-csoport PLA esetén) növeli a degradációs időt (PGA<PLA) • Üvegesedés: Az üvegesedési hőmérséklet (Tg) felett a rugalmassá váló polimerek láncai mozgékonyabbak, így a víz számára könnyebben hozzáférhetőek • Kristályos szerkezet csökkenti, az amorf struktúra növeli a degradáció időtartamát