HPLC-UV-ESI-MS-TLC 联用筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂

HPLC-UV-ESI-MS-TLC联用筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂 答辩人：朱桃玉指导老师：马志玲副教授

目录 • 前言 • 实验 • 结果与讨论 • 结语与展望

第一部分前言 • 选题意义 • 研究现状 • 实验策略 • 创新之处

1.1 选题意义 • 乙酰胆碱酯酶抑制剂是治疗老年性痴呆病的临床药物。 • 本实验以合成的混合物为研究对象，把高效液相色谱法、质谱法以及薄层色谱法成功地应用于筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂的合成产物，为寻找更多的药物信息提供了一种新的方法。

1.2 经典研究方法 主要合成产物易提纯体系先导药物合成分离提纯测定生物活性难提纯体系副产物？？经典方法的局限性： 1)只适合易提纯体系； 2)只注重主要合成产物的信息

1.3 实验策略 条件优化最佳展开剂的确定二维TLC分离检测混合物测定抑制活力最小检测量的确定 pH的影响条件优化离子对试剂的影响分离三乙胺的影响合成混合物 HPLC定量定量借助氢谱 LC-MS定性结论

1.4 创新之处 • 合成产物的混合体系不经提纯直接进行筛选，特别适合难提纯体系 • 对合成过程中的副产物进行筛选，从而获得更多有用信息 • 实现了各种色谱方法的联用 • 发展了多维薄层色谱法分离同分异构体，同时在薄层板上检测其生物活性

第二部分实验 • 研究体系 • 仪器 • 试剂 • 实验方法

2.1 研究体系 主要合成路线氢谱图质谱图红外图谱

2.2 仪器 • TLC aluminium sheets Silicagel 60 F254(merck公司） • 可调式移液器（Thermolabsystems,0.5～10μL） • 1100型高效液相色谱仪（Aligent公司），配有二级管阵列检测器，化学工作站（Agilent ChemStation for LC 3D） • 液相－质谱联用仪（Thermo Finigan公司），配有ESI离子源，化学工作站

2.3 主要试剂 • 乙酰胆碱酯酶抑制剂混合物（合成产物） • 乙酰胆碱酯酶（Sigma公司） • 氯化乙酰胆碱（Sigma公司） • 5，5－二巯基双－2－硝基苯甲酸（Sigma公司）

2.4 实验方法 • 二维薄层色谱法分离测定抑制活力 • HPLC分离测定混合物 • LC-MS定性

展开剂体系 2.41 二维薄层色谱法分离混合物 • 第一维：三氯甲烷：甲醇＝9：1；0.4 mL 0.1 mol/L的三乙胺甲醇溶液；0.3 mL 0.1 mol/L的HCl甲醇溶液；1.0 mL 10 mmol/L的十二烷基硫酸钠甲醇溶液。流动相走过的距离为5.3 cm； • 第二维：三氯甲烷：甲醇＝9：1，流动相走过的距离为8.0 cm • 两维之间的干燥时间：5 min

2.42二维薄层色谱法测定抑制活力 • 取2.5 μL样品溶液点板，在二维展开剂体系展开。逐次喷上氯化乙酰胆碱溶液、DTNB溶液，待硅胶板干燥后喷上新鲜的酶液。5分钟后观察现象。 • 分别配制2～0.05 mmol/L的样品溶液，依照上述方法，测定该方法的最小检测量

实验结果 混合物经二维TLC的分离结果最小检测量的测定结果 1：2 mmol/L 2:1 mmol/L 3:0.5 mmol/L 4: 0.2 mmol/L 5:0.1 mmol/L 6:0.05 mmol/L 结论：用薄层色谱法可以鉴别出具有抑制能力的化合物。同时，可以粗略地测出各种化合物的抑制能力的大小。

pH的影响 2.42高效液相色谱法分离测定混合物条件优化结论：在不加入其它改善剂时，随着pH值的变化，面积及保留时间几乎没有什么变化；但pH越大，造成的拖尾现象越严重。因而，小的pH有利于分离。

离子对试剂的影响 改变十二烷基苯磺酸钠溶液的浓度，按照同一梯度进行测定。观察其浓度对于分离的影响。结论：加入了离子对试剂后，各组分由于分子的空间结构不同，从而在固定相上的保留不同，进而得以分离。我们采用的十二烷基苯磺酸钠的浓度为30 mmol/L

三乙胺的影响 未加入三乙胺 100：2 100：4 100：6 结论：从上图可以看出三乙胺的加入可以改善峰型的拖尾。当1％甲酸－三乙胺＝100：4时，各种化合物已经基本达到分离；当继续增加三乙胺的量，分离又逐渐变差。本实验采用的1％甲酸－三乙胺的比例为100：4。

色谱条件 • 色谱柱：Hypersil ODS2 C18 4.6mm×50mm 5um • 检测波长：426 nm • 流速：1 ml/min • 进样量：20μL • 流动相：甲醇；1 ％甲酸－三乙胺＝100：4；30 mmol/L十二烷基苯磺酸钠采用以下淋洗梯度进行分离测定

梯度淋洗 • t/min A % B % D % • 0 20 78 2 • 6 20 78 2 • 8 20 65 15 • 17 100 0 0 • 23 100 0 0 其中，A为甲醇； B为1 ％甲酸－三乙胺溶液； D为十二烷基苯磺酸钠溶液。

实验结果 ② ③ ① ⑤ ④ 混合物经HPLC的分离结果 HPLC三维色谱图混合物中各种物质的相对含量

2.33 液相－质谱确定分子结构 色谱条件：色谱柱：Hypersil BDS C18 2.1 mm×50 mm 3 um 毛细管温度：350 ℃ 喷射电压：3500 V 辅气：鞘气进样量：20 μL 流动相：甲醇、1 ％甲酸

梯度条件 • t/min A % B ％ • 0 5 95 • 6 10 90 • 12 70 30 • 25 100 0 其中，A为甲醇；B为1 ％甲酸

实验结果 398 398 261 226 261 226 tr＝9.275 tr＝11.775 398 758 261 226 255 480 tr＝13.080tr＝19.880，20.066

结论 ① ② ⑤ 其中，①、②、③、⑤分别为保留时间9.275、11.775、13.080、20.066所对应的结构式。而19.880的结构式有待进一步确定。 ③

第三部分实验结论 ③ ② ⑤ ① ④ 抑制能力最强的是④和⑤号化合物。其次是①、②和③号化合物，而这三者的抑制能力相似。

结语与展望 • 本实验成功地把各种色谱方法应用于合成产物的筛选中，进而提供更多的药物信息。如果能把该方法应用于天然产物的筛选，则对于寻找新药有着重大的意义。

致谢 • 本论文是在马志玲副教授直接指导下完成的。马老师悉心的指导，让我不仅学会了各种仪器的使用，还学会了她待人处世的态度和一丝不苟的敬业精神。借此机会，我对马老师表示最衷心的感谢！ • 在实验的过程中，我同时得到了吴京洪老师的细心的指导和帮助。在此，我对吴老师表示衷心的感谢! • 在实验的过程中，我还得到了陆毅和庞朝乐师兄的热心帮助。在此，我对他们表示衷心的感谢！ • 另外，本论文的顺利完成和何文蔚、杨欣卉等同学的配合与帮助是分不开的，在此作一并致谢！

谢谢大家!

HPLC-UV-ESI-MS-TLC 联用筛选乙酰胆碱酯酶抑制剂