Suivi moléculaire des patients L’analyse d’ADN tumoral circulant : le point de vue du biologiste

1. Suivi moléculaire des patientsL’analyse d’ADN tumoral circulant :le point de vue du biologiste Jean-Louis Merlin Institut de Cancérologie de Lorraine Service de Biopathologie CNRS UMR7039 CRAN Université de Lorraine

2. On en parle dans le journal…

3. C’est nouveau, ça vient de sortir…

4. On savait déjà que c’était faisable… • Chen XQ et al, Microsatellite alterations in plasma DNA of small cell lung cancer patients. Nat Med. 1996 Sep;2(9):1033-5 • Nawroz H et al, Microsatellite alterations in serum DNA of head and neck cancer patients. Nat Med. 1996 Sep;2(9):1035-7. • Mohiuddin M et al, C-Ki-ras mutations in peripheralblood of pancreatic cancer patients: a marker for earlytumormetastasis. Int J RadiatOncolBiol Phys. 1996 Jan 1;34(1):161-6.

5. ADN tumoral circulant Schwarzenbach et al, Nat Rev Cancer, 2011

6. D’où ça vient ? Schwarzenbach et al, Nat Rev Cancer, 2011

7. De nombreuses études… Schwarzenbach et al, Nat Rev Cancer, 2011

8. Intérêt : diagnostic moléculaire et suivi thérapeutique Murtaza et al, Nature 2013

9. Le point technique… • Les seuils de détection des différentes méthodes utilisées pour analyser les mutations à partir d’ADN extrait de tissu hétérogène sont variables • 10-20% pour le séquençage direct • 5-10 % pour les techniques de PCR • <10-6 pour les techniques de PCR digitale • Ces seuils ont un impact potentiel direct sur le diagnostic moléculaire exprimé de façon « binaire » (cfTougeron ASCO 2012)

10. Avec les gènes, ilfaut savoir cequel’onveut…

11. PCR haute sensibilité • De nombreuses techniques de PCR permettent de détecter et d’analyser des quantités très faibles d’ADN • Digital PCR • Dropletdigital PCR • BeamingPCR • IntPlex • Ces techniques permettent d’analyser l’ADN circulant

12. Digital PCR • Répartition d’un échantillon en une multitude de réactions de PCR • Identification des portions portant la mutation (positif) et des portions ne portant pas l’anomalie recherchée (négatif) • Une réaction de PCR est effectuée sur chacune des molécules d’ ADN • L’étude du rapport négatif/positif permet ainsi de déterminer un nombre de copies d’ADN muté, sans avoir recours à des contrôles internes

13. Digital PCR (Roche Diagnostics, Life Technologies) « Diluer pour mieux…quantifier » Light Cycler 1536 Plaque 1536 puits Vol : 0.5 à 2 ml

14. 2. Après amplification, chaque gouttelette produit un signal fluorescent positif ou négatif indiquant si la mutation cible est présente ou non. 1. Échantillon réparti dans 20 000 gouttelettes contenant la cible d’intérêt et l’ ADN non muté distribués au hasard dans les gouttelettes DropletDigital PCR 3. Les gouttelettes + et - sont comptées dans l’échantillon puis calcul par un logiciel de la c° d’ADN en copies/ml

15. Droplet digital PCR (Biorad)

16. Raindrop digital PCR (Raindance) Pekin et al Lab Chip, 2011

17. 1ère Etape 2ème Etape BeadsEmulsification Amplification & Magnetics 3ème Etape 4ème Etape

18. BEAMing (Inostics) Richardson AL, Iglehart JD, Clin Cancer Res, 2012

19. Avantages / Inconvénients Baker M, Nat Meth, 2012

20. Etude A. Thierry et al. ASCO 2012

21. ADN tumoral < 200 bp Mouliere F, Thierry AR. Expert OpinBiolTher. 2012 Jun;12 Suppl 1:S209-15

22. Intplex • Q-PCR spécifique d’allèle • Méthode très spécifique • Détection de la mutation et détermination de la concentration d’ ADN circulant • Utilisation d’un bloqueur spécifique d’allèle • empêche l’amplification des séquences non mutées 60 pb 60 pb 1. la prise en compte de la taille des ADNcir (<135 bp) 2. compare l’amplification de séquences de même taille, et de même région (300 bp) 3. Allelespecific avec agent blocker pour grande spécificité 4. Design expérimental apportant une grande sensibilité (~0.005%, mutant to WT ratio) 5. Cout réduit et très rapide « data turnaround time » (2 jours, ~3 fois plus rapide que Beaming ou Fluidigmbasedmethods) 6. Méthode générale et équipement de routine (vs outsourcedanalysis telle que Beaming) 22 Thierry A.R., confidentiel Thierry AR et al, 2012, Nature Med, en révision 300 pb

23. Sensibilité : ≤0,01% pour chaque mutation Sensitivity (mutant/WT copy number): KRAS G12V (0.005%) G12R (0.005%) G12C (0.01%)G12D (0.009%)G12S (0.004%) G12A (0.005%) G13D (0.005%) BRAFV600E (0.004%) Intplexa été testé sur 29 échantillons de plasma d’individus sains  pas de mutations détectées. Sur les échantillons cliniques de patients mCRC, le plus faible niveau de charge mutée KRAS trouvée est de 0.013 %. 23 Thierry A.R., confidentiel Thierry AR et al, 2012, Nature Med, en révision

24. Concordance avec ADN extrait du tissu tumoral Thierry A.R., confidentiel

25. Conclusion : Yeswecan ! • L’analyse de l’ADN circulant est en plein essor • Concept de « Biopsie liquide » à valider • Suivi thérapeutique • Emergence de résistance… • Biomarqueurs et techniques à valider • LOE • Spécificité, sensibilité • Validation de méthodes, assurance qualité • Délais : techniques avec analyse centralisée vs technique utilisables sur site • Implémentation sur les plateformes INCa ?

26. Merci… • Maëva Lion et Alexandre Harlé (ICL, Nancy) • Pierre Laurent-Puig (HEGP, Paris) • Alain Thierry (IRCM, Montpellier) Si vous cherchez la source du fleuve vous la trouverez dans les gouttes d’eau sur la mousse