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ELISA 综合性实验二

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ELISA 综合性实验二 - PowerPoint PPT Presentation


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ELISA 综合性实验二. 综合性实验设计方案探讨 ELISA 最佳工作浓度的选择. —— 此次试验提供 0.5mg/mL 的包被抗体原液每组 300μl ( 经过一系列的预实验,现在我们抗体包被的浓度范围缩小为 10μg/mL ~ 60μg/mL ) 。 —— 包被用 Na 2 CO 3 缓冲液每组各 10ml —— 酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组 10ml —— 1:50 酶标抗体液每组 100μl (预实验后工作浓度范围缩小在 1:2000 ~ 1:10000 之内)

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Presentation Transcript
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综合性实验设计方案探讨ELISA最佳工作浓度的选择综合性实验设计方案探讨ELISA最佳工作浓度的选择
  • ——此次试验提供0.5mg/mL的包被抗体原液每组300μl (经过一系列的预实验,现在我们抗体包被的浓度范围缩小为10μg/mL ~ 60μg/mL)。
  • ——包被用Na2CO3缓冲液每组各10ml
  • ——酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组10ml
  • ——1:50酶标抗体液每组100μl(预实验后工作浓度范围缩小在1:2000~1:10000之内)
  • ——800μg/mL的检测抗原原液每组800μl(自己调整检测浓度,此次试验强阳性抗原为400μg/mL、弱阳性抗原浓度为20μg/mL、阴性直接加抗原稀释液 )
  • ——聚苯乙烯酶标板条3条,共36孔
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实验设计操作要求
  • 包被抗体、酶标抗体、检测抗原浓度的确立;
  • 聚苯乙烯板条每孔加包被抗体液100μL,4℃包被48h。
  • 弃去孔内液体,每孔加200μL封闭液,4℃封闭24h。
  • 弃去封闭液,风干,检测(检测时每孔所加的各稀释度的酶标液和抗原都为100μL ),结果分析。
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标本检测的原理
  • 将特异性抗体包被固相载体,加入受检标本(抗原)使之与固相载体上的抗体结合成抗体抗原复合物,加入酶标抗体形成抗体抗原酶标抗体复合物,加入底物显色。
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实验材料与仪器
  • 待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀释液、酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液
  • 滴管、吸管、微量加样器、移液管
  • 酶标仪、温育箱
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操作

在酶标板条的孔中加入相应浓度的抗原(100UL/孔)

↓37℃×30min

弃孔内液体,用洗涤液洗3遍,30s/次

↓拍干

加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔

↓37℃×30min

弃去孔内液体,同上洗涤三次

↓拍干

加底物A、B液各2滴(100UL/孔)

↓37℃×15min

显色后加终止液1滴(50UL/孔)

酶标比色仪450nm读取OD 值

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棋盘滴定法选择最佳工作浓度
  • 选择标准:强阳性参考血清A值为0.8左右

阴性参考血清A值<0.1

(即:选择强阳性对照孔最接近0.8,且阴性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标浓度为最佳的ELISA检测浓度。)

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实验设计要求
  • 在实验本上绘出36孔设计图表
  • 写出实验中选择的包被液的情况
  • 写出实验中选择的包被抗体、酶标抗体、检测抗原的浓度,和系列稀释方案。
  • 写出最终测得的OD值并分析实验结果。

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评价
  • 双抗体夹心ELISA法简单易行,不需复杂的仪器设备,特异性强、敏感性高,其中一步法更简单、省时,但有Hook效应的缺点。
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Ab + Ag  Ab  Ag (b复合物) (1)

Ab  Ag+Ab*  Ab  Ag  Ab* (a复合物) (2)

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ELISA影响因素实验设计

第一组:边缘效应

第二组:叠加效应

第三组:温浴方式

第四组:加样方式

第五组:洗涤次数

第六组:温浴时间

第七组:试剂温度

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小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方案,下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可行性,讲述时间为2-3分钟左右。小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方案,下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可行性,讲述时间为2-3分钟左右。

要求设计方案中包括:

  • 实验对象、标本要求
  • 操作条件、操作过程(可画出96孔加样示意图或对比示意图等)
  • 结果判断标准
  • 结果分析方式