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ELISA 综合性实验二. 综合性实验设计方案探讨 ELISA 最佳工作浓度的选择. —— 此次试验提供 0.5mg/mL 的包被抗体原液每组 300μl ( 经过一系列的预实验，现在我们抗体包被的浓度范围缩小为 10μg/mL ～ 60μg/mL ) 。 —— 包被用 Na 2 CO 3 缓冲液每组各 10ml —— 酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组 10ml —— 1:50 酶标抗体液每组 100μl （预实验后工作浓度范围缩小在 1:2000 ～ 1:10000 之内）
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综合性实验设计方案探讨ELISA最佳工作浓度的选择综合性实验设计方案探讨ELISA最佳工作浓度的选择 • ——此次试验提供0.5mg/mL的包被抗体原液每组300μl (经过一系列的预实验，现在我们抗体包被的浓度范围缩小为10μg/mL ～ 60μg/mL)。 • ——包被用Na2CO3缓冲液每组各10ml • ——酶标抗体稀释液、抗原稀释液每组10ml • ——1:50酶标抗体液每组100μl（预实验后工作浓度范围缩小在1:2000～1:10000之内） • ——800μg/mL的检测抗原原液每组800μl（自己调整检测浓度，此次试验强阳性抗原为400μg/mL、弱阳性抗原浓度为20μg/mL、阴性直接加抗原稀释液 ） • ——聚苯乙烯酶标板条3条，共36孔
实验设计操作要求 • 包被抗体、酶标抗体、检测抗原浓度的确立； • 聚苯乙烯板条每孔加包被抗体液100μL，4℃包被48h。 • 弃去孔内液体，每孔加200μL封闭液，4℃封闭24h。 • 弃去封闭液，风干，检测（检测时每孔所加的各稀释度的酶标液和抗原都为100μL ），结果分析。
标本检测的原理 • 将特异性抗体包被固相载体，加入受检标本（抗原）使之与固相载体上的抗体结合成抗体抗原复合物，加入酶标抗体形成抗体抗原酶标抗体复合物，加入底物显色。
实验材料与仪器 • 待检抗原原液、酶标抗体、抗原稀释液、酶标稀释液、酶标板条、洗涤液、显色液A、显色液B、终止液 • 滴管、吸管、微量加样器、移液管 • 酶标仪、温育箱
操作 在酶标板条的孔中加入相应浓度的抗原（100UL/孔） ↓37℃×30min 弃孔内液体，用洗涤液洗3遍，30s/次 ↓拍干 加所设计的不同工作浓度的酶标抗体100UL/孔 ↓37℃×30min 弃去孔内液体，同上洗涤三次 ↓拍干 加底物A、B液各2滴(100UL/孔) ↓37℃×15min 显色后加终止液1滴(50UL/孔) ↓ 酶标比色仪450nm读取OD 值
棋盘滴定法选择最佳工作浓度 • 选择标准：强阳性参考血清A值为0.8左右 阴性参考血清A值<0.1 （即：选择强阳性对照孔最接近0.8，且阴性孔小于0.1的孔所对应的包被浓度和酶标浓度为最佳的ELISA检测浓度。）
实验设计要求 • 在实验本上绘出36孔设计图表 • 写出实验中选择的包被液的情况 • 写出实验中选择的包被抗体、酶标抗体、检测抗原的浓度，和系列稀释方案。 • 写出最终测得的OD值并分析实验结果。 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
评价 • 双抗体夹心ELISA法简单易行，不需复杂的仪器设备，特异性强、敏感性高，其中一步法更简单、省时，但有Hook效应的缺点。
Ab＋Ag＋Ab* Ab Ag Ab* ＋Ab Ag ＋Ag Ab*＋Ab* Ag Ab* a b c d
Ab ＋ Ag Ab Ag （b复合物） (1) Ab Ag＋Ab* Ab Ag Ab* （a复合物） (2)
ELISA影响因素实验设计 第一组：边缘效应 第二组：叠加效应 第三组：温浴方式 第四组：加样方式 第五组：洗涤次数 第六组：温浴时间 第七组：试剂温度
小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可行性，讲述时间为2-3分钟左右。小组讨论结束后每组写出一份具体的试验设计方案，下节课上每组派代表上台讲述实验方案和可行性，讲述时间为2-3分钟左右。 要求设计方案中包括： • 实验对象、标本要求 • 操作条件、操作过程（可画出96孔加样示意图或对比示意图等） • 结果判断标准 • 结果分析方式
