critically appraised topic prv 1 gen een nieuwe moleculaire merker voor polycythemia rubra vera l.
Download
Skip this Video
Loading SlideShow in 5 Seconds..
Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” PowerPoint Presentation
Download Presentation
Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 41

Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera” - PowerPoint PPT Presentation


  • 485 Views
  • Uploaded on

Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”. Danielle Van der beek Assistent klinisch biologie UZ-Leuven 14-12-2004. Inhoud. Polycythemia Rubra Vera Symptomen Diagnose

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

Critically Appraised Topic : PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”


An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
critically appraised topic prv 1 gen een nieuwe moleculaire merker voor polycythemia rubra vera

Critically Appraised Topic:PRV-1 gen “Een nieuwe moleculaire merker voor Polycythemia Rubra Vera”

Danielle Van der beek

Assistent klinisch biologie

UZ-Leuven

14-12-2004

inhoud
Inhoud
  • Polycythemia Rubra Vera
    • Symptomen
    • Diagnose
  • PRV-1 gen overexpressie: een nieuwe moleculaire marker voor Polycythemia Rubra Vera
    • PRV-1 gen en RQ-PCR
    • Critical Appraisel
      • Analytische performantiekarakteristieken
      • Diagnostische performantiekarakteristieken
      • Klinische impact
      • Organisatorische impact
      • Kostprijs
      • Decision making
polycythemia rubra vera
PolycythemiaRubra Vera
  • Myeloproliferatieve ziekte
    • Verworven mutatie van een hematopoëtische pluripotente stamcel
      • Afwijkingen in de drie mergreeksen
    • Klassiek onderscheidt men (FAB):
      • Polycythemia Rubra Vera
      • Essentiële trombocytose
      • Myelofibrose
      • Chronische myeloïde leukemie
symptomen
Symptomen
  • 6e – 7e levensdecade, Incidieus
  • Hyperviscositeit: hoofdpijn, duizeligheid, visusstoornissen, neusbloedingen, diffuse pijnen in de ledematen en abdomen
  • Tromboseneiging (perifeer + centraal)
  • Jeuk
  • Plethora
  • Splenomegalie
  • Bloedingen (GI)
diagnose 1
Diagnose (1)

Verhoogde rode bloedcel massa

  • Absolute of relatieve erytrocytosis?
  • HTC > 56% (♀) of 60% (♂): PV na uitsluiten secundaire oorzaken (PVSG)
  • Hb > 16,5 g/dL (♀) of 18,5 g/dL (♂): major criterium (WHO)

Heike L Pahl, Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004, Expert Rev. Mol. Diagn. 4(4), 2004

diagnose 2
Diagnose (2)

Primaire of secundaire polycytemie?

Carboxyhemoglobine gehalte?

UpToDate Online version 12.2 (2004)

diagnose 3
Diagnose (3)
  • EPO dosage
    • Relatief eenvoudig - CHU Sart TilmanLuik
    • Laag erytropoëtine gehalte: primaire erytrocytosis
    • Hoog erytropoëtine gehalte: secundaire erytrocytosis
  • Beenmergkweek:
    • Autonoom in vitro laten groeien van endogene erytroïde koloniën (EEK’s)
    • Omslachtig, arbeidsintensief, moeilijk te standaardiseren, niet kosten-effectief
  • Morfologisch onderzoek van het beenmerg:
    • Weinig zinvol, enkel in DD. andere myeloproliferatieve ziekten
    • Geen criterium voor diagnosestelling van PV
diagnose 4
Diagnose (4)
  • Histologisch onderzoek van beenmergbiopt:
    • Kan diagnose van PV bevestigen
    • ↑ aantal grote megakaryocyten in clusters,

proliferatie van de 3 mergreeksen met

vooral proliferatie van de erytropoïese

hyperplasie van gedilateerde sinussen

  • Cytogenetische afwijkingen:
    • Slechts in 10 – 20% afwijkend
    • Bewijs klonale aandoening
diagnose 5
Diagnose (5)

Gemodifieerde PVSG-criteria volgens Berlin (2000)

WHO. Tumors of the Hematopoietic and lymphoid tissues. IARC Press, Lyon, France (2001)

diagnose nieuwe testen 6
Diagnose – nieuwe testen (6)
  • Verminderde expressie van de TPO receptor

(c-Mpl) in plaatjes en megakaryocyten[Moliterno et al]

    • Proliferatie van plaatjes in PV is onafhankelijk van TPO, cfr. RBC – epo
  • Mbv. ELISA platelet-rich plasma (PRP) serotonine levels meten in pt met myeloproferatieve aandoeningen: lagere levels in patiënten met PV, ET en myeloïde metaplasie in vergelijking met secundaire polycytemie en controle patiënten
  • Overexpressie van PRV-1 mRNA
prv 1 gen
PRV-1 gen?
  • PRV-1 mRNA overexpressie in de granulocyten van perifeer bloed bij PV i.t.t. SE, CML, AML

In fysiologische toestand expressie in het beenmerg

perifeer bloed, geen beenmerg!

  • PRV-1 proteïne levels verschillen niet tussen PV en gezonde personen geen flowcytometrie, geen ELISA
  • PRV-1 gen
    • Behoort tot de uPAR/Ly6/CD39 receptoren
    • Chromosoom 19 band region q13.12-2
    • Overexpressie mogelijks door aberrante transcriptie, geen structurele wijziging van het gen
    • Rol in de pathofysiologie van PV?
principe real time pcr
Principe real-time PCR
  • Oligo dT primer bindt mRNA
  • RT maakt 1e streng cDNA aan
  • RT heeft endo H aktiviteit
  • Dubbelstrengs cDNA
principe real time pcr16
Principe real-time PCR
  • Denaturatie = splitsen van ds cDNA (95°)
  • Annealing = binden van de primers (60°)
  • Extension = vormen van een complementaire cDNA-streng mbv Taq-polymerase (60°)

R

Q

Real-time PCR: fluorofoor gelabelde probe!

slide17

R

Q

  • Probe bestaat uit 5’ reporter label en een 3’ quencher label
  • Probe wordt afgebroken door de 5’ nuclease aktiviteit van het Taq- polymerase => fluorescentie ↑
  • Ontstaan van 2 nieuwe identieke ds cDNA ketens
  • Opnieuw denaturatie, annealing,
slide18

R

R

Q

Q

R

R

Q

Q

  • extension, denaturatie, annealing, …
  • Exponentiële vermenigvuldiging van de gewenste DNA-sequentie
slide19

Afbraak van de probe => R komt vrij => toename in fluorescentie, uitgedrukt in CT-waarde

  • De CT-waarde (cycle treshold) is die cyclus waarbij een bepaalde drempelwaarde voor fluorescentie overschreden wordt
  • Kwantitatieve bepaling: aan de hand van een IJKLIJN met standaard DNA en CT-waarden
standaardcurve 1
Standaardcurve (1)
  • Met behulp van een plasmide:
    • 4018 Kbp lang
    • Bevat fragmenten van het PRV-1 gen en het house-keeping gen GAPDH (Dr. M.R. Veldwijk, German Cancer Research Center, Heidelberg)
    • Plasmide transformatie naar E. coli DH5α, dan amplificatie
    • Plasmideconcentratie meten in het lysaat
    • Lineariseren van het plasmide
    • Dn concentratie geknipt plasmide meten
    • M.b.v. MW : aantal kopieën plasmiden berekenen
  • GUS (ß-glucuronidase): commerciële kit
standaardcurve 2
Standaardcurve (2)
  • Seriële standaardreeks:
    • 103 kopieën/5µL
    • 104 kopieën/5µL
    • 105 kopieën/5µL
  • Na uitvoeren PCR: aantal kopieën t.o.v. CT-waarde
    • Standaardcurve voor GUS
    • Standaardcurve voor PRV-1
  • Elk staal (in triple):
    • Aantal kopieën PRV-1
    • Aantal kopieën GUS

=> Ratio kopieën PRV-1/GUS

clinical bottom line
Clinical bottom line
  • Kwantitatieve analyse van PRV-1 mRNA expressie met behulp van ‘real-time polymerase chain reaction’ is nuttig bij de diagnose van Polycythemia Rubra Vera of ziekte van Vacquez.
  • De nieuwe parameter kan gebruikt worden bij patiënten met erytrocytosis, gestegen hematocriet en/of gestegen hemoglobine voor de differentiële diagnose tussen primaire en secundaire erytrocytosis.
1 analytische performantiekarakteristieken
1. Analytische performantiekarakteristieken
  • Pre-analytische variabelen
    • Perifeer bloed, EDTA-staal
    • Flebotomie, hydroxyurea en interferon-α hebben een invloed op PRV-1 overexpressie
    • Bij pt met erytrocytosis moet een infectieus probleem uitgesloten worden alvorens PRV-1 expressie te gebruiken bij de diagnosestelling
    • Staalstabiliteit: RNA extractie / aanmaken van cDNA gebeurt best binnen de 24u
slide25
2. Analytische parameters
  • intra-assay variatie:
    • Elk staal wordt in triple uitgevoerd
    • Het gemiddelde van het aantal cDNA kopieën, corresponderend bij de respectievelijke CT waarden, wordt gebruikt voor de PRV-1/GUS ratio
    • Gemiddelde intra-CV (%CT) (n = 23): 0,83%
      • 1,27% voor PRV-1
      • 0,39% voor GUS
slide26
inter-assay variatie:
    • Bij elke run wordt er een standaardcurve gemaakt m.b.v. een plasmide
    • Voor 5 runs: CV’s van de CT’s voor 1000, 10000 en 100000 kopieën/5µL
slide27
Accuraatheid (bias):afhankelijk van accuraatheid van de standaarden. Het opstellen, synthetiseren, zuiveren en kalibraties van DNA standaarden is van belang
  • Vergelijking met EPO dosage (n = 16):
    • Sensitiviteit PRV-1 100%, specificiteit PRV-1 100%
    • Groot aantal stalen met normaal EPO gehalte!
    • Prijs EPO: 17 € Prijs PRV-1 expressie: +/- 105 €
slide28
Lineariteit: correlatiecoëfficiënt

Binnen de range van 1 tot 1.106: lineair verband tussen log cDNA en de CT waarden.

  • Referentie range:
    • ≥ 130: PV bevestigen! (TO DO)
    • < 130: geen PV
  • Analytische range:

Rekening gehouden met de amplificatie limiet (betrouwbaar vanaf 50 kopieën), is het analytische bereik 20 tot 40 CT’s.

  • Turn around time (TAT):max. 1x/maand en min. 1x/2 maanden
slide29
Inschatting van het aantal te verwachten aanvragen
    • a.d.h.v. EPO dosage:
      • 51 aanvragen in 2003
      • 48 aanvragen in 2004 (jan-okt)
    • 52 aanvragen verkregen, waarvan 9 uit de periferie (17%)
  • Kwaliteitscontrole: doel = de reproduceerbaarheid van de PCR bevestigen.
    • IQC:

Het plasmide met zijn verdunningen is een controle op de verschillende stappen van de PCR

Bij elke PCR moet de efficiëntie hetzelfde zijn E=10(-1/slope)-1

    • EQC: (nabije?) toekomst
2 diagnostische performantiekarakteristieken
2.Diagnostische performantiekarakteristieken

M. Bossuyt, “Towards complete and accurate reporting of studies of diagnostic accuracy: The STARD initiative.” Clin. Chemistry 2003;49:1,1-6

slide33

PV

Niet-PV

slide34

Diagnostisch aspect:

    • nut bij diagnose PV (DD. prim/sec erytrocytosis)
    • Evt. EPO dosage en/of EEK’s vervangen
    • Cytologie levert geen meerwaarde op in de diagnostiek van PV (tenzij DD. myeloproliferatieve ziekte)
    • Botboorbiopsies: richtinggevend
    • cytogenetica: minderheid +
  • Behandeling:
    • interferon: down-regulatie van PRV-1 expressie
    • PRV-1 expressie: merker voor klinische respons?
  • Health outcome: juiste diagnosestelling! In de literatuur (nog) geen evidentie dat PRV-1 gen bepaling de outcome verbetert
  • Prognose en follow-up: /

3. Klinische impact

slide35
4. Organisatorische impact
  • Impact in het ziekenhuis:
    • Beenmergcytologie is geen criterium. Morfologisch onderzoek vergt +/- 1 uur werk voor MLT/GSO-ASO/supervisor
    • Beenmergkweek is tijdrovend en kostelijk. Momenteel wordt het enkel uitgevoerd bij twijfel over de diagnose (http://intranet/patientenzorg/procedures.protocols.html)
    • Er is geen verkorting hospitalisatieduur (meestal ambulante setting)
  • Is PRV-1 geïncorporeerd in klinische richtlijnen of guidelines?

H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4)

    • ‘European Leukemia Network’ zal binnen enkele maanden guidelines publiceren voor de standaardisatie van het RQ-PCR assay
    • Voorstel PVSG criteria verder aan te passen
slide36

Diagnose PV:

A1 + A2 + A3 of A4

A1 + A2 + twee B’s

H. L. Pahl “Diagnostic approaches to polycythemia vera in 2004” Expert Rev. Mol.Diagn., 2004;4(4)

slide37
5. Kostprijs: binnen en buiten het labo
  • Actuale kost

Rekening houdend met de reagenskost, distributiekosten, primaire en secundaire activiteiten:

105 € per patiëntenstaal in batch van 10 stalen

  • Terugbetaling

CMD’s ontvangen een ‘enveloppe’, geen RIZIV tussenkomst

  • Voordeel elders in het ziekenhuis
      • PRV-1 kan EPO dosage vervangen
      • PRV-1 expressie + EPO dosage kan beenmergkweek vervangen (moeilijke standaardisatie, arbeidsintensief, niet kosten-effectief)
      • RBC-massa bepaling is niet steeds nodig (volgens clinici routinematig aangevraagd)

– HTC > 56% (♀), HTC > 60% (♂) => PV (PVSG)

– Hb > 16,5 g/dL (♀), Hb > 18,5 g/dL (♂) : major criteria volgens WHO

slide38
6. Decision making
  • Impact van PRV-1 op het klinisch beslissing proces
    • VOORSTEL DIAGNOSEREGEL:
      • Klinische vermoeden van PV Uitsluiten ET !
      • HTC > 52 % (♂), HTC > 48 % (♀) (uptodate)
      • HTC > 50% (♂), HTC > 48% (♀) (http://intranet/patientenzorg/procedures.protocols.html)
    • Beenmergmorfologie is een overbodig onderzoek
    • RBC massa bepaling is niet steeds nodig
  • Past de test binnen het eigen labo profiel?
    • De test staat volledig op punt. De PCR is gelijkaardig aan andere real-time PCR’s: minimum aan opleiding MLT
    • Lage frequentie test: uitvoeren indien er tijd is
    • Stalen opsturen naar ander labo: verlies kwaliteit (cfr. Stabiliteit!)
  • Besluit: flowchart
slide39

Vermoeden PV

WHO

Trombocytosis (> 400 x 109/l)

WBC (> 12 x 109/l)

Splenomegalie (klinisch/echo)

Gestegen hematocriet / hemoglobine

STAP 1

DD Absolute of relatieve erytrocytose?

STAP 2

PVSG

WHO *

HTC > 56% vrouw

HTC > 60% man

Hb > 16,5 g/dl vrouw

Hb > 18,5 g/dl man

Relatieve erytrocytose: diurectica, dehydratatie, vochtsequestratie

Ja: stap 3

Neen: RBC-massa bepalen

STAP 3

Absolute erytrocytose: secundaire of primaire erytrocytose?

  • zuurstofsaturatie: gedaald
  • carboxyhemoglobinegehalte verhoogd: rookstop 3-4m
  • PRV-1 expressie
  • botbiopsie
  • cytogenetica
  • (EPO)
  • (beenmergkweek)

*Dit criterium is minder streng aangezien 18,5 g/dl en 16,5g/dl ongeveer overeenkomt met een hematocriet van 54 en 48

slide40

TO DO / ACTIONS

  • Reëvalutie cut-off
  • Opstellen van een werkvoorschrift indien de test in de routine komt
  • Aanvragers uit periferie verwittigen voor staalstabiliteit
slide41

Dank u voor uw aandacht!

Speciale dank aan:

Dr. N. Boeckx

Dr. J. Frans

Frans Houtmeyers

Prof. F. Van Stapel