slide1 n.
Download
Skip this Video
Download Presentation

Loading in 2 Seconds...

play fullscreen
1 / 32

- PowerPoint PPT Presentation


  • 142 Views
  • Uploaded on

Enzymová kinetika. Enzym ová kineti ka. studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek zabývá se faktory, které ovlivňují r ychlost reakcí katalyzovaných enzymy Rychlost enzymové reakce závisí na: koncentrace substr á t ů koncentraci enzymu

loader
I am the owner, or an agent authorized to act on behalf of the owner, of the copyrighted work described.
capcha
Download Presentation

PowerPoint Slideshow about '' - acacia


Download Now An Image/Link below is provided (as is) to download presentation

Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author.While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server.


- - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - E N D - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - - -
Presentation Transcript
enzym ov kineti ka
Enzymová kinetika
  • studuj časový průběh enzymové reakce za různých reakčních podmínek
  • zabývá se faktory, které ovlivňují rychlost reakcí katalyzovaných enzymy

Rychlost enzymové reakce závisí na:

  • koncentrace substrátů
  • koncentraci enzymu
  • Fysikálně chemické vlastnosti prostředí (iontová síla, pH, teplota...)
  • Přítomnost aktivátorů a inhibitorů

Proč studovat enzymovou kinetiku?

  • Charakterizace substrátové preference enzymů
  • Identifikace a studium inhibitorů
typy enzymov ch reakc
Typy enzymových reakcí

Jednosubstrátové reakce

  • Jeden substrát jeden produkt (isomerasy)
  • Jeden substrát dva produkty (lyasy)
  • Jeden substrát a voda dva produkty (hydrolasy)

Dvousubstrátové reakce

  • Dva substráty dva produkty (oxidoreduktasy, transferasy)
  • Dva substráty jeden produkt (lyasy)

Třísubstrátové reakce

  • Dva substráty a ATP  jeden hlavní produkt a dva produkty z ATP (ligasy)
z vislost reakce na koncentraci substr tu a enzymu
Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu
  • V roce 1902 Brown studoval rychlost hydrolytického štěpení sacharosy na fruktosu enzymem b-fruktofuranosidasou:
  • sacharosa + H2O glukosa + fruktosa
  • Při konstantní koncentraci sacharosy (a různé koncentraci enzymu) byla závislost počáteční rychlosti reakce na koncentraci enzymu lineární
z vislost reakce na koncentraci substr tu a enzymu1
Závislost reakce na koncentraci substrátu a enzymu
  • Pokud je koncentrace enzymu konstatní, a mění se koncentrace substrátu, je závislost počáteční rychlosti na koncentraci substrátu hyperbolická
enzymov kinetika
Enzymová kinetika

Leonor Michaelis

Maud Menten

enzym ov kineti ka matematick odvozen

Enzymová kinetika – matematické odvození

Cíl: vypracování rovnice vyjadřující rychlost katalyzované reakce

Jako příklad uvažujme jednoduchou nekatalyzovanou reakci:

S ===> P

Rychlost reakce je charakterizována rychlostí přírůstku produktu P

Reakční rychlost je přímo úměrná koncentraci substrátu [S]

rovnice michaelise a mentenov
Rovnice Michaelise a Mentenové

k1 kcat

E + S <===> ES ===> P + E

k-1

Základním předpokladem je existence komplexu enzym-substrát (ES)

K1je rychlostníkonstantapro tvorbu ES (rychlost = k1[E][S])

K-1jerychlostní konstantapro disociaci ES (rychlost = k-1[ES])

Celková rychlost reakceje:

rovnice michaelise a mentenov1

Nemůžeme ale snadno měřit [ES]. Cílem je stanovit [ES] jako funkci parameterů které můžeme měřit.

  • Michaelis a Mentenová použili dva základní předpoklady:

Rovnice Michaelise a Mentenové

  • 1. Předpokládáme, že k1 ak-1jsou podstatně větší než kcat, takže enzym a substrát jsou v rovnováze.
    • V rovnováze je rychlosttvorby komplexu [ES] stejná jako rychlost jeho disociace, takže:
    • k1[E][S] = k-1[ES]
    • Po úpravě:
    • kde KSje definovánajakorovnovážná disociační konstanta.
rovnice michaelise a mentenov2

Rovnice Michaelise a Mentenové

2.Předpokládáme žepočáteční koncentrace substrátu [S]o, je mnohem větší než celková koncentrace enzymu [E]tot, takže během prvé periody enzymové reakce (než je spotřebována podstatná část substrátu), je koncentrace volného substrátu stejná jako původní celková koncentrace substrátu (která je při expertimentu známa):

tj.. [S]o >> [E]tottakže [S] ≈ [S]o

Omezíme pozorování a výpočty pouze na počáteční rychlost reakce.

rovnice michaelise a mentenov3

E + S <===> ES ===> P + E

Rovnice Michaelise a Mentenové

Enzym není v průběhu reakce spotřebováván, takže:

[E]tot = [E] + [ES]

Náhrada za [E] (zavedení KS):

Přeskupení:

Tedy:

rovnice michaelise a mentenov4

Rovnice Michaelise a Mentenové

Totoje rovnice hyperboly. Pro [S] v kcat[E]totkterou definujeme jakovmax. Máme tedy:

kde vmax = kcat[E]tot

(Připomenutí: [S] ≈ [S]o a vje počáteční rychlost reakce.)

zero order

1st order

[S] = Low → High

enzymov kinetika podle briggs e a haldane a

v or [ES]

Steady state

Time

Nemůžeme předpokládat, že k1 a k-1jsou vždy větší než kcat

Místo předpokladu rovnováhy mezi E, S a ES, uvažujeme tvorbu ustáleného stavu. Předpokládáme, že (pro [S]o >> [E]tot) reakce rychle dosáhne stav během kterého je koncentrace [ES] konstantní.

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

Předpokládáme tedy:

Reakční schéma je:

k1 kcat

E + S <===> ES ===> P + E k-1

reakční rychlost v = kcat[ES]

slide14

Konstantní koncentrace ES v ustáleném stavu

Concentration

Reaction Time

S

P

ES

E

enzymov kinetika podle briggs e a haldane a1

v or [ES]

Steady state

Time

k1 kcat

E + S <===> ES ===> P + E k-1

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

k1 [E][S] = k-1[ES] + kcat [ES]

Úprava:

Tedy:

kde KMje známa (nepřesně!!) jako Michaelisova konstanta.

Pokud k-1 >> kcat, KM KS (= k-1/k1).

enzymov kinetika podle briggs e a haldane a2

Pro výpočet reakční rychlosti použijeme stejný postup:

Enzym není spotřebován: [E]tot = [E] + [ES]

Náhrada za [E] (z výrazu proKM):

Úprava:

Tedy:

kdevmax = kcat[E]tot.

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

enzymov kinetika podle briggs e a haldane a3

Vmax[S]

vo =

Km+[S]

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

Tyto dva postupy vedou k podobným rovnicím:

Michaelis-Menten

Briggs-Haldane

enzymov kinetika podle briggs e a haldane a4

Double-reciprocal Lineweaver-Burke Plot

1/v

KM/vmax

1/vmax

1/[S]

-1/KM

B-H poskytuje obecnějšírovnici pro rychlost enzymových reakcí. Pro usnadnění výpočtů je často používána v reciproké formě. Převrácením obou stran rovnice dostaneme:

Graf 1/vproti 1/[S] poskytuje přímku se směrnicí KM/vmaxa úsekem na ose y o hodnotě 1/vmax

Enzymová kinetika podle Briggse a Haldanea

slide19

Km: Afinitavůči substrátu

Vmax[S]

vo =

Km+[S]

Vmax

Ifvo =

2

Vmax

Vmax[S]

=

2

Km+[S]

Km+[S] = 2[S]

Km= [S]

Km

When using different substrate

Vmax

S2

S1

S3

1/2

S1S2S3

Affinity changes

d le itost k m
Důležitost KM
  • Nezávisí na koncentraci enzymu
  • Závisí na reakčních podmínkách
  • Hlavní substrát má nejnižší KM
  • Koncentrace substrátu pro dosažení limitní rychlosti je cca 100 KM
slide22

Km: příklad hexokinasy

CHO

H-C-OH

HO-C-H

H-C-OH

H-C-OH

H2-C-OH

CHO

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

H-C-OH

H2-C-OH

CHO

HO-C-H

HO-C-H

H-C-OH

H-C-OH

H2-C-OH

Glucose + ATP → Glc-6-P + ADP

Substrát

Glukosa

Allosa

Manosa

číslo

1

2

3

4

5

6

Km = 8 8,000 5 mM

slide23

Číslo přeměny, molární aktivita enzymu, kcat

k1

kcat

E + S ES E + P

(vo)

k2

kcat, číslo přeměny (turn over number, t.o.n)

Počet molekul substrátu přeměněných jednou

molekulou enzymu za jednu sekundu

slide24

Číslo přeměny vybranýchenzymů

Enzymy

Substrát

kcat(s-1)

KatalasaH2O2

40,000,000

Karbonát-hydrolyasaHCO3-

400,000

AcetylcholinesterasaAcetylcholin

140,000

2,000

b-LaktamasaBenzylpenicilin

FumarasaFumarát

800

Počet molekul produktu získanéhoze substrátu

jednou molekulou enzymuza sekundu

Adapted from Nelson & Cox (2000) Lehninger Principles of Biochemistry (3e) p.263

slide25

Jak stanovit KM aV

1

vo

vo

1

Vmax

- 1

Km

1/S

S

1)použij známé množstvíenzymu→E

2)přidej substrátv různých koncentracích→S(osa x)

3)změř produkt v určeném čase (P/t) →vo(osa y)

4)(x, y) graf, hyperbolickákřivka, limita →Vmax

5)pokud y = 1/2 Vmaxspočti x ([S]) →Km

Vmax

1/2

Km

Double reciprocal

Direct plot

slide26

Jednotky enzymovéaktivity

Specifická

aktivita

y

x

=

= tan

S →Pmmol

t

Produkt [P]

vo = [P]/min

směrnice

tan

mmol

/min

Unit =

0 10 20 30 40

Reakčnídoba(min)

Jednotky aktivity

y

Protein (mg)

x

slide27

kcat/Km (katalytická účinnost) chymotrypsinu

O RO

H3C–C–N–C–C–O–CH3

HH

=

=

Norvalin

–CH2–CH2–CH3

3.6 ╳ 102

Norleucin

–CH2–CH2–CH2–CH3

3.0 ╳ 103

–CH2–

Phenylalanin

1.0 ╳ 105

kcat / Km

R =

Glycin

–H

1.3 ╳ 10-1

(M-1 s-1)

Adapted from Mathews et al (2000) Biochemistry (3e) p.379

jak zv it rychlost reakce

Vmax[S]

vo =

Km+[S]

  • přídavek enzymu (zvýšení [E]tot)
  • přídavek substrátu (zvýšení [S])
  • modifikace enzymu(optimalizace kcatnebo KS)

Jak zvýšit rychlost reakce

kinetika v cesubstr tov ch reakc
Kinetika vícesubstrátových reakcí
  • Nejčastěji přeměna dvou substrátů na dva produkty
  • Reakce může probíhat různými mechanismy
mechanismus n sledn postupn sekven n uspo dan
Mechanismus následný (postupný, sekvenční) uspořádaný
  • Vazba prvého substrátu A změna konformace komplexu (indukované přizpůsobení) vazba druhého susbtrátu B (volný enzym má pro něj malou afinitu) vznik komplexu EAB
  • Přeměna komplexu EAB na EPQ (enzym s reakčními produkty)
  • Postupné oddělení jednoho a poté druhého produktu
  • Využíván např. u oxidoreduktas (substrát A je NAD+)
mechanismus n sledn postupn sekven n n hodn
Mechanismus následný (postupný, sekvenční) náhodný
  • Pokud nezáleží na sledu vazby substrátů na enzym a na pořadí uvolňování produktů
  • Enzym má zhruba stejnou afinitu k oběma substrátům
mechanismus ping pongov
Mechanismus ping-pongový
  • Na enzym se naváže prvý substrát, dojde k reakci, oddělí se prvý produkt
  • Substrát předá nějakou skupinu  enzym se uvolní v pozměněné formě
  • Poté připojení druhého substrátu, který převezme od enzymu skupinu z prového substrátu
  • Poté uvolnění produktu a obnova enzymu
  • Transferasy