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Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico

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Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico - PowerPoint PPT Presentation


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Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico. Metti il DNA e le cellule insieme. Fai qualcosa di speciale. Scatola nera. Poi succede qualcosa ……. Trasformazione batterica Uptake of DNA nudo , spesso un plasmide circolare. Cell wall. GFP. Bacterial chromosomal DNA.

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Presentation Transcript
trasformazione di cellule competenti con dna plasmidico
Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico

Metti il DNA e le cellule insieme

Fai qualcosa di speciale

Scatola nera

Poi succede qualcosa …….

trasformazione batterica uptake of dna nudo spesso un plasmide circolare
Trasformazione battericaUptake of DNA nudo, spesso un plasmide circolare

Cell wall

GFP

Bacterial

chromosomal DNA

Beta lactamase

(ampicillin resistance)

pGLO plasmids

metodi di trasformazione
Metodi di trasformazione
  • Elettroporazione
    • shock elettrico che rende le membrane cellulari permeabili al DNA(si usa anche per le lellule eucariotiche)
  • Calcio cloruro/Heat Shock
    • Cellule, rese competenti chimicamente, incorporano DNA nudo dopo heat shock
ruolo del cacl 2 per rendere le cellule competenti
Ruolo del CaCl2 perrendere le cellule competenti
  • CaCl2 genera buchi nella membrana dei batteri rendendoli capaci di incorporare DNA
ruolo del cacl 2 per rendere le cellule competenti cont

Ca++

O

Ca++

O

P

O

Base

O

O

CH2

Sugar

O

Ca++

O

O

P

Base

O

O

CH2

Sugar

OH

Ruolo del CaCl2 perrendere le cellule competenti- cont
  • Gli ioni of Ca+2 carichi positivamente mascherano le cariche negative dei gruppi fosfato presenti nel DNA
attenzione
Attenzione!!!!
  • CaCl2 rende le cellule più fragili
  • Delicatezza (ghiaccio e pipettata gentile)
trasformazione di cellule competenti con dna plasmidico7
Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico

Metti il DNA e le cellule insieme

45 minuti

in ghiaccio

Il DNA aderisce ai batteri

Shock termico

42 °C per 2 min

Il DNA entra nei batteri

trasformazione di cellule competenti con dna plasmidico cont
Trasformazione di cellule competenti con DNA plasmidico - cont

Periodo di recupero a 37 °C in presenza di terreno che

permette la replicazione del DNA plasmidico

nelle cellule in cui è entrato

1 ora a 37 °C

Questo periodo permette alle cellule di esprimere

il gene di resistenza all’ antibiotico

(ampicillina) e di potere

replicare successivamente sulle piastre

spread plate12
Spread plate
  • Piastre rigorosamente asciutte
  • MAI piastrare più di 300 µl o MENO di 50 µl
  • Raffreddare bene la bacchetta di vetro
  • Lasciare asciugare prima di spostare le piastre
  • Le piastre danno conteggi affidabili solo se il numero di colonie é tra 30 e 500
finalmente

Finalmente….

Se non avete la disponibilità di un incubatore a 37 °C potete lasciare le piastre sul banco. Vedrete le colonie dopo 2 3 giorni.

efficienza di trasformazione colony forming unit cfu g dna
EFFICIENZA DI TRASFORMAZIONEColony Forming Unit (CFU)/µg DNA
  • Calcolre i µg totali di DNA usati
  • Calcolare il fattore di diluizione della piastratura (se é stata fatta)
  • Contare le colonie
  • Moltiplicare il numero di colonie per la

diluizione di piastratura

  • Dividere per i ng di DNA utilizzato
  • Efficienza di trasformazione (CFU/g)= n°colonie

 g DNA