1 / 191

Bahan Kuliah KCKT

HPLC THEORY and PRACTICE

M33
Download Presentation

Bahan Kuliah KCKT

An Image/Link below is provided (as is) to download presentation Download Policy: Content on the Website is provided to you AS IS for your information and personal use and may not be sold / licensed / shared on other websites without getting consent from its author. Content is provided to you AS IS for your information and personal use only. Download presentation by click this link. While downloading, if for some reason you are not able to download a presentation, the publisher may have deleted the file from their server. During download, if you can't get a presentation, the file might be deleted by the publisher.

E N D

Presentation Transcript

  1. KCKT KromatografiCair Kinerja TinggiTM 11ByApt M.Erwin Yamashita

  2. CONTENTS Definisi dan prinsipdasar KCKT Sisteminstrumentasialat Teori dasarkromatografiInteraksifase diam dan fasegerak,mekanismepemisahankoefisiendistribusi (partisi, adsorpsi, ion exchange, eksklusiukuran). Parameter kinerjakromatografi: faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  3. DEFINISI KCKT Kromatografi KCKT (KromatografiCair Kinerja Tinggi), yang dikenaldalambahasaInggrissebagai High Performance Liquid Chromatography (HPLC), adalahmetodeanalisiskromatografi yang digunakanuntukmemisahkan, mengidentifikasi, dan mengukurkomponendalamsuatucampurancairbiasanyadenganTekanan Tinggi. Teknik inibekerjadengancaramemompalarutansampel (analit) yang dilarutkandalamfasagerak (biasanyacair) melaluikolom yang berisifasa diam.  HPLC berupayauntukmemisahkanmolekulberdasarkanperbedaanafinitasnyaterhadapzatpadattertentu. Cairan yang akandipisahkanmerupakanfasecair dan zatpadatnyamerupakanfasediam (stasioner).

  4. PRINSIP DASAR KCKT Kerja HPLC pada prinsipnyaadalahpemisahananalit-analitberdasarkankepolarannya, alatnyaterdiridarikolom (sebagaifasa diam) dan larutantertentusebagaifasageraknya.

  5. PRINSIP DASAR KCKT Yang paling membedakanHPLC dengankromatografilainnyaadalah pada HPLC digunakantekanantinggiuntukmendorongfasagerak. Campurananalitakanterpisahberdasarkankepolarannya, dan kecepatannyauntuksampaikedetektor (wakturetensinya) akanberbeda, haliniakanteramati pada spektrum yang puncak-puncaknyaterpisah. HPLC dapatmenganalisasecarakualitatif dan kuantitatif. Pada proses kualitatifcara yang paling umumuntukmengidentifikasiadalahdenganmelihatRetention time (RT). Hasil analisa HPLC diperolehdalambentuksignal kromatogram. Dalam kromatogramakanterdapat peak-peak yang menggambarkanbanyaknyajeniskomponendalam sample.

  6. SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system)

  7. SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) https://youtu.be/eCj0cRtJvJg?si=xZuRIVTGXAulqEUI

  8. SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) 1. Fase Gerak dan Reservoir Pelarut Fase gerak pada HPLC harusmenggunakanpelarutdengankemurnian sangat tinggi. Idealnya, pelarutkhusus yang memangsudahmemenuhi standard untuk HPLC dipergunakanuntukhasil yang lebihakurat. Reservoir pelarutmerupakanwadahpenyimpananfasegerak, biasanyaberbentukbotolkacadenganselangpenghubung.

  9. 2. Pompa SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Pompa yang digunakandalam HPLC haruslahpompabertekanantinggi agar dapatmendorongfasegerakdalam reservoir menujukolomfasediam dan melewatidetektor. Tekanan yang digunakanberagamtergantungdaridimensikolom, ukuranpartikelfasediam, sertalajualir dan komposisidarifasegerak yang akandipakai. https://youtu.be/sBtjuu1mMI8?si=xC1-sIcms8a1Ezq7

  10. 3. Injektor SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Injektormerupakantempatmasuknyasampelkedalamsistem HPLC. Proses injeksidapatdilakukansecara manual dengansyringeataudenganmenggunakansisteminjeksiotomatis. Injektor pada HPLC harusdapatmenampungsampelcairandalamkisaran volume 0.1-100 mL. https://youtu.be/phEUtXyKa9Q?si=SEaZQiK1wth9Jezu

  11. 4. Sampel SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Sampel yang dapatdianalisismenggunakan HPLC harusbersifatbening dan tidakadaendapan, untukitupreparasisampeldiperlukansebelumdianalisis, misalnyadenganmelakukanfiltrasisampel. Preparasi lain dapat pula dilakukansesuaikebutuhansepertimengaturkonsentrasisampel, desalting, dan lain-lain.

  12. Sampel PREPARASI SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Sampel yang dapatdianalisismenggunakan HPLC harusbersifatbening dan tidakadaendapan. Sample Mestidifiltrasi

  13. 5. Kolom SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Kolom HPLC tersediadalampanjangsertapacking material yang berbeda-bedatergantungdarijenis HPLC yang hendakdigunakan. Packing material merupakan material yang diisikankedalamkolomsebagaifase diam. Packing material yang seringdigunakanbiasanya yang berbasissilika, baik silica yang tidakdimodifikasi (Fase normal) maupun yang telahtermodifikasisepertiOktaDesil Silan (ODS) yang memilikilapisanC18 non polar (Fase terbalik) Di dalamkolomakanterjadipemisahankomponensampel yang kemudiandapatdihitungwakturetensi masing-masing komponennya oleh detektor. Waktu retensiadalahwaktu yang dibutuhkan oleh senyawakomponensampeluntukmelewatikolommenujudetektor. Waktu retensidihitungdarisaatsampeldiinjeksikanhinggapuncakpembacaanmaksimum pada detektor.

  14. Isi Kolom SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system)

  15. SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Fase diambersifat nonpolar (hidrofobik), sedangkanfasegeraknyabersifatberair, polar sedang. Jenis HPLC inibekerjaberdasarkanprinsipinteraksihidrofobikmakasemakin nonpolar bahantersebut, semakin lama akandipertahankan. Teknik yang digunakanuntukmolekul non-polar, polar, terionisasi, dan ionik.

  16. 6. Detektor SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Refractive Index (RI) Detector Evaporative Light Scattering Detector (ELSD) UV/VIS Absorption Detectors (UV Ds) The Fluorescence Detector (FD) Electrochemical Detectors (ECDs) Conductivity Detector ( CD ) MS Detector, NMR Detector Alat iniberfungsiuntukmendeteksikeberadaankomponen yang telahmelewatikolom dan memberikansinyalelektronik pada pengolah data. Terdapatbeberapajenisdetektor HPLC tergantungdarikarakteristik yang hendakdibaca. Misalnya pada detektorjenis UV-vis, makakarakteristik yang dibaca oleh detektoradalahabsorbansinya. Detektorjenis lain yang bisadigunakanadalahdetektorindeks bias, fluoresensi, sertadetektorelektrokimia.

  17. Mekanisme Detektor SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system)

  18. SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system)

  19. 7. Pengolah data SISTEM INSTRUMENTASI ALAT (7 system) Pengolah data menampilkan output visual hasilanalisis yang terbaca oleh detektordalambentukkromatogram. Kromatogrammenggambarkanjumlahkomponen pada sampeldilihatdarijumlahpuncak (peak) yang dihasilkan. Konsentrasikomponen yang hendakdianalisisdapatdihitungdenganmembandingkanluas area peakkomponendenganluas area peak sertakonsentrasistandar.

  20. KROMATOGRAFI Dalam kromatografi, dikenalbeberapaistilah, yaitu : Analitialahzat yang dipisahkan. Kromatogramialah output visual yang didapatkandarihasilpemisahan. Adanya ujungkarakterisitik yang berbedainibisamenandakanadanyasenyawa yang berbeda. Eluenialahpelarut yang bisadigunakanuntukmemisahkananalit. Fasagerakialahfasazat yang bergerak pada arahtertentu. Fasadiamialahfasa yang tetap pada tempatnya. Waktu retensiialahwaktu yang dibutuhkananalituntukmelewatisistem. Volume retensiialah volume fasagerak yang diperlukanuntukmengelusikomponenanalit.

  21. KROMATOGRAFI Prinsip Dasar Kromatografiadalah: Pemisahanberdasarkandistribusikomponensampel di antara dua fasa : fasadiam dan fasagerak. Fasagerakmengakibatkanmigrasidiferensialkomponendalamsampel. Fasadiamtidakbolehbereaksidenganfasagerak. Komponensampelharuslarutdalamfasegerak dan berinteraksidenganfase diam. Fasagerakharusmengalirmelewatifasediam, yang harusterikatkuat di posisinya. 

  22. KROMATOGRAFI

  23. KROMATOGRAFI

  24. KROMATOGRAFI

  25. KROMATOGRAFI Dalam kromatografi, analisisdilakukandengancaramemisahkanmolekulberdasarkanperbedaanstrukturataupunkomposisinya. Pemisahantersebutterjadisaatsampelbergerakmelewatifasediam (dapatberupazatpadatataucair) karenaterbawa oleh fasegerak (dapatberupazatcairatau gas).

  26. KROMATOGRAFI

  27. KROMATOGRAFI

  28. KROMATOGRAFI

  29. KROMATOGRAFI

  30. KROMATOGRAFI

  31. 1. Kromatografi Fase Normal: Kromatografifase normal merupakanteknikperintisdalamkromatograficair. Teknik inimelibatkanfasestasionerdenganpolaritas yang lebihtinggidaripadafasemobil. Fase mobilbiasanyaterdiridaripelarut yang polaritasnyalemahseperti n-alkana, sedangkanfasestasionerterdiridaribahan polar seperti gel silika. Teknik inimemanfaatkanprinsipkesamaan dan kompatibilitas, memisahkansenyawaberdasarkaninteraksipolaritasnyadenganfasestasioner. Teori dasarkromatografiInteraksifase diam dan fasegerak,mekanismepemisahankoefisiendistribusi (partisi, adsorpsi, ion exchange, eksklusiukuran). 2. Kromatografi Fase Terbalik: Kromatografifaseterbalik, yang sekarangbanyakdigunakan, beroperasisecaraterbalikdarikromatografifase normal. Di sini, fasebergerak sangat polar (misalnya, metanol-air), sedangkanfasediambersifat polar lemah, sering kali terdiridaribahansepertioktadesilatau C18 kolomDenganmemodifikasipermukaan gel silikadenganrantai C18 hidrofobik, kolommemfasilitasipemisahansenyawaberdasarkansifathidrofobiknya. Kromatografifaseterbalikmenawarkanbeberapakeuntungandibandingkanfase normal, termasukpenerapan yang lebihluas, penggunaanpelarut yang lebihaman, dan fleksibilitas yang lebihbesardalampemilihanfasebergerak.

  32. 3. KromatografiInteraksiHidrofilik (HILIC): HILIC mengisicelahuntuksenyawa yang tidakcocokuntukanalisisfase normal ataufaseterbalik, seperti gula. Denganmemanfaatkankolom yang miripdengankromatografifase normal dan fasebergerak yang menyerupaikondisifaseterbalik (misalnya, asetonitril/air), HILIC memungkinkanpemisahansenyawa yang sangat polar. Teknik initelahmendapatkanpopularitas, khususnyadalamaplikasi LC-MS, karenakemampuannyauntukmelarutkansampelsecaraefektifsambilmemastikanpemisahan yang tepat. Teori dasarkromatografiInteraksifase diam dan fasegerak,mekanismepemisahankoefisiendistribusi (partisi, adsorpsi, ion exchange, eksklusiukuran). 4. KromatografiPasangan Ion dan KromatografiPertukaran Ion : Untuksenyawa yang memerlukaninteraksi ion yang ditingkatkan, kromatografipasangan ion dan kromatografipertukaran ion sangat berguna. Kromatografipasangan ion melibatkanpenambahanreagenpasangan ion kefasebergerakuntukmeningkatkaninteraksiantaraanalit dan fase diam. Di sisi lain, kromatografipertukaran ion memisahkansenyawaberdasarkansifatmuatannya, sehinggacocokuntukmemisahkan ion atausenyawa yang dapatterionisasi.

  33. Teori dasarkromatografiInteraksifase diam dan fasegerak,mekanismepemisahankoefisiendistribusi (partisi, adsorpsi, ion exchange, eksklusiukuran). 5. Kromatografi Gel: Tidak sepertimetodekromatografilainnya, kromatografi gel terutamamemisahkansenyawaberdasarkanukuran, bukanpolaritas. Dikenal juga sebagaikromatografipengecualianukuran, kromatografiinimelibatkanfasestasionerberpori yang dilaluimolekul yang lebihbesaruntukkeluarlebihcepatdaripadamolekul yang lebihkecil. Kromatografi gel digunakanuntukmemisahkanbiomolekul dan polimerberdasarkanukuranmolekulnya.

  34. 1. Waktu Retensi Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak Waktu retensi adalah ukuran waktu mulai injeksi cuplikan hingga suatu komponen campuran keluar kolom atau waktu yang diperlukan oleh suatu komponen campuran (solute) untuk keluar dari kolom. Waktu retensi diukur melalui kromatogram dari menit ke-0 hingga muncul puncak peak. Peak pertama (t0) yang muncul pada kromatogram disebabkan oleh komponen yang tidak berinteraksi dengan fasa diam, seperti udara dalam KG dan pelarut sampel dalam HPLC., tidak dianggap sebagai komponen campuran yang sedang dipisahkan.

  35. 2. Faktor kapasitas(k’ ) Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak Faktor kapasitasadalahukurankemampuankolommempertahankankomponensampel. Faktor kapasitasmerupakanwaktuzatterlarutberadadalamfasediamrelatifterhadapwaktudalamfasegerak . Nilai faktorkapasitasdapatdihitungdenganpersamaansebagaiberikut : K’ <1 Resolusikurangbaik,senyawamenumpuk di t nol K’ rentangnya 1 - 10

  36. 2. Faktor kapasitas(k’ ) Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak Nilai k’ iniselaludihubungkandenganefektifitasmetode Analisa. Senyawa-senyawa yang mempunyai harga faktor kapasitas tinggi menunjukkan komponen tersebut berinteraksi dengan fasa diam secara kuat. Komponen-komponen yang mempunyai harga faktor kapasitas rendah menunjukkan komponen tersebut berinteraksi dengan fasa diam secara lemah.

  37. 3. EFISIENSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  38. 3. EFISIENSI Dalam Teori Lempeng Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  39. 3. EFISIENSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  40. 3. EFISIENSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  41. 3. EFISIENSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  42. 4. SELEKTIFITAS Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak k1’ dan k2’ masing2 adalah faktor kapasitas komponen pertama dan kedua. Bila harga α = 1 berarti senyawa 1 dan 2 keluar dari kolom bersama-sama (senyawa 1 tidak dapat dipisahkan dari senyawa 2). Bila harga α > 1, maka senyawa 1 keluar dari kolom lebih cepat dari pada senyawa 2. Semakin besar harga α semakin baik pemisahan.

  43. 5. RESOLUSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  44. 5. RESOLUSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  45. 5. RESOLUSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  46. 6. BENTUK PEAK KROMATOGRAM Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak Tailing Factor = TF Harga TF > 1 Terjadi tailing TF<1 Fronting

  47. 6. RETENSI RELATIF Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak Merupakanperbandingandari 2 faktorkapasitas . Sering juga disebutsebagaifaktorpemisahanatauselektifitasdimanamengindikasikankemampuanfasediam dan fasegerakdalammemisahkan 2 senyawa. Retensirelatif = k’2 / k’1

  48. 7. VOLUME RETENSI Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak

  49. 7. LUAS PUNCAK /KURVA KROMATOGRAM Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak LUAS PUNCAK ,LUAS segitiga = ½ H x W

  50. 7. LUAS PUNCAK /KURVA KROMATOGRAM Parameter kinerjakromatografi:faktorkapasitas, lajupemisahan, wakturetensi, volume retensi, retensirelatif, teorilempeng, teorilaju,resolusi, asimetrispuncakluaspuncak Nilai Area= Luas Kurva atauluaspuncak

More Related