L INIZIO DELLA VITA UMANA: ASPETTI BIOLOGICI E MEDICI dr Gabriella Bozzo

1. L�INIZIO DELLA VITA UMANA: ASPETTI BIOLOGICI E MEDICIdr Gabriella Bozzo Corso di Formazione per Operatori e Insegnanti dei Metodi Naturali di Conoscenza della Fertilit� LODI 08/11/08

3. Dove si verifica

4. I Protagonisti della fecondazione: i gameti

5. Il viaggio degli spermatozoi � Meno dell�1% degli spermatozoi eiaculati raggiunge gli ovidotti. Si ha quindi una elevata competizione tra gli spermatozoi

6. Il viaggio degli spermatozoi Nella cavit� uterina in genere, la motilit� della muscolatura (prostaglandine, movimenti peristaltici, ecc.) favorisce la risalita degli spermatozoi; si tratta pur sempre di un percorso lunghissimo per lo spermatozoo che esaurisce rapidamente le energie disponibili. Pare che gli spermatozoi non si distribuiscano casualmente tra le due tube, ma che una notevole percentuale si diriga verso la tuba uterina corrispondente all�ovaio in cui si � avuta la maturazione dell�ovocita (fertilizine?). La giunzione utero-tubarica rappresenta infine un altro passaggio difficile. Alla fine, meno di 100 spermatozoi raggiunger� l�ovocita (1/5000000).

7. L�ovocita

8. Gli eventi della Fecondazione Una volta che i due gameti si sono incontrati nell�ambiente tubarico, la fecondazione richiede una serie ordinata di eventi: Capacitazione dello spermatozoo Penetrazione attraverso le cellule del cumulo ooforo Legame dello spermatozoo alla zona pellucida Reazione acrosomiale Penetrazione nella zona pellucida Legame alla membrana dell�ovocita Attivazione dell�ovocita e reazione corticale Reazione della zona pellucida Eventi successivi alla fecondazione

10. 1- Capacitazione dello spermatozoo La capacitazione si verifica spontaneamente dopo una permanenza di alcune ore nelle vie genitali femminili. Si ritiene che dipenda sia dalla rimozione di alcuni gruppi glucidici dalle proteine di membrana, sia dalla rimozione o demolizione di altre proteine, sia dal legame con proteine che destabilizzano la membrana, legandosi ai fosfolipidi e facilitando la sottrazione di colesterolo dalla membrana stessa. .

11. 2- Penetrazione attraverso le cellule del cumulo ooforo Gli spermatozoi devono farsi strada tra le cellule della corona radiata, che sono relativamente poco compattate. Alcuni spermatozoi hanno una reazione acrosomiale anticipata, con liberazione di ialuronidasi, che favorisce la disaggregazione delle cellule del cumulo . Tali spermatozoi non riusciranno per� a penetrare nella zona pellucida.

12. 3- Legame dello spermatozoo alla zona pellucida Gli spermatozoi incontrano poi la zona pellucida, costituita da carboidrati. Il legame � mediato da proteine e comporta un riconoscimento specie-specifico.

13. 4- Reazione acrosomiale La proteina della membrana pellucida ZP3, principale proteina riconosciuta dalla membrana dello spermatozoo, stimola la reazione acrosomiale, cio� la fuoriuscita del contenuto (enzimi litici) dell�acrosoma. ZP3 stimola una serie di reazioni mediate da una complessa trasduzione del segnale. In tal modo gli spermatozoi possono farsi strada nella zona pellucida, trasformando nel contempo la stessa ZP3. La reazione acrosomiale comporta una fusione tra la membrana plasmatica e quella acrosomiale nella regione anteriore. Si osserva una specie di vescicolazione.

14. lo spermatozoo perde porzioni crescenti di acrosoma e di membrana plasmatica dalla porzione anteriore (vedi animazione). Se la reazione non si � verificata fuori tempo, lo spermatozoo pu� giungere fino all�oolemma. la reazione acrosomiale progredisce�

15. 5- Penetrazione nella zona pellucida Per la penetrazione nella zona pellucida lo spermatozoo ricorre a due sue propriet�: il corredo di enzimi litici e la spinta del flagello.

16. 6- Legame alla membrana dell�ovocita Attraversata la membrana pellucida, lo spermatozoo si pu� legare alla membrana plasmatica dell�ovocita. Il legame avviene nella regione postero-laterale della testa dello spermatozoo, in una zona dove non era presente l�acrosoma

17. 7- Attivazione dell�ovocita e reazione corticale Appena lo spermatozoo si � legato alla membrana dell�ovocita, questo subisce una serie di rapide reazioni. Attivazione metabolica Completamento della II divisione meiotica con espulsione del II globulo polare Reazione corticale TUTTI QUESTI FENOMENI SONO SCATENATI DALL�INFLUSSO DI CALCIO DOVUTO ALLA PENETRAZIONE DELLO SPERMATOZOO. SI DETERMINA COS� DEPOLARIZZAZIONE DELLA MEMBRANA E CONSEGUENTE APERTURA DI CANALI DEL CALCIO.

18. L�INFLUSSO DI CALCIO

19. 8 - La reazione corticale La reazione corticale consiste in una massiccia esocitosi dei granuli corticali successiva all�attivazione dell�ovocita. I granuli corticali contengono una miscela di enzimi, tra cui diverse proteasi, che diffondono nella zona pellucida, inducendo la reazione zonale. Queste proteasi alterano la struttura della zona pellucida, rendendola impenetrabile da ulteriori spermatozoi. Anche alcune proteine della membrana plasmatica vengono alterate e gli spermatozoi circostanti vengono distrutti.

20. - Reazione della zona pellucida La reazione della zona pellucida determina il blocco della polispermia. Infatti si attuano i seguenti cambiamenti: indurimento (nessuno spermatozoo riuscir� pi� a penetrarvi) distruzione dei recettori (alterazione di ZP3)

21. 9 - Eventi successivi alla fecondazione In seguito al legame con la membrana plasmatica, lo spermatozoo penetra nell�ovocita. In particolare, la sua testa viene incorporata nel citoplasma. La membrana nucleare si disperde e il nucleo comincia a scambiare le protammine con degli istoni di origine materna, decondensandosi rapidamente. Un nuovo involucro nucleare circonda quindi il nucleo maschile. Con lo spermatozoo, nella specie umana, entra anche il flagello, che fornisce il centrosoma dello zigote. I microtubuli dello spermatozoo si mescolano con quelli dell�ovocita, mentre i mitocondri vengono di norma distrutti. Intanto il nucleo dell�ovocita ha completato la II divisione meiotica, con l�espulsione del II globulo polare..

22. L�ANFIMISSI I due nuclei aploidi, ora indistinguibili e denominati PRONUCLEI, vanno contemporaneamente ma indipendentemente in fase S, attraversano la fase G2 ed entrano in mitosi. L�unione dei due patrimoni genetici (anfimissi) ha luogo in metafase, dove i cromosomi dei due partners si mescolano, ricostituendo il patrimonio diploide. Lo zigote, dividendosi, va a formare due blastomeri, poi quattro�.

23. L�EMBRIONE Dal momento della fusione dei gameti gli elementi di origine paterna e materna contribuiscono, grazie ad un completo e coordinato scambio, all�attivit� del nuovo organismo allo stadio unicellulare : un intenso lavoro di auto-organizzazione del nuovo sistema per iniziare nella direzione giusta tutto il necessario sviluppo ( PMA � L�Embrione Umano nella Fase Preimpianto� Ed Vaticana)

24. L�EMBRIONE Costituzione degli assi dello sviluppo - non cumulo indistinto di cellule - totipotenza = grande capacit� di compensazione di un ev. danno e non indipendenza ( posizione del globulo polare/punto di entrata dello spermatozoo/forma dell�ovocita fecondato) Seconda divisone cellulare importante per il destino delle cellule : 1- massa cellulare interna 2- annessi embrionari

25. L�EMBRIONE I un periodo di 5 giorni l�embrione procede secondo divisione cellulari regolate da numerosi geni �segmentazione � mentre viene spinto dalla tuba nell�utero Le cellule sono via via pi� piccole � blastomeri- che si organizzano in una morula. Allo stadio di 8/16 cellule si ha una compattazione di queste con la formazione di tight junctions fra le cellule esterne e di gap junctions fra le cellule interne , entrambe hanno funzione di scambio di molecole per regolare e coordinare le divisioni cellulari.

26. L�EMBRIONE Le cellule pi� esterne formano il trofoblasto - chorion Le cellule pi� interne formano la massa cellulare interna - embrione (cell stam) - sacco vitellino - amnios - allantoide

27. L�EMBRIONE Al 4� giorno di sviluppo la morula si trasforma in blastocisti che presenta una cavit� interna detta blastocele che contiene liquido filtrato grazie alla presenza di una pompa sodio/potassio nelle cellule esterne che trasporta ioni sodio e quindi acqua nella cavit� centrale . Ora le cellule sono 64/128 distinte in 3 tipi istologicamente differenti

28. IL DIALOGO MATERNO � EMBRIONALE : comunicazione biochimica, ormonale , immunologica L�embrione possiede fattori di crescita e di autoregolazione fino dalle ore successive alla fecondazione che gli permettono anche di guidare l�impianto nell�utero materno. Esiste un cross-talk ( dialogo reciproco) che inizia gi� nella tuba attraverso la zona pellucida La tuba secerne sotto lo stimolo degli estrogeni ovarici fattori di crescita che agiscono sugli spermatozoi prima e sull�embrione poi. L�epitelio dell�utero produce fattori che modulano il numero delle cellule della massa interna

29. L�IMPIANTO NELL�UTERO:apposizione/ adesione/penetrazione Fra il 3� e il4� giorno dalla fecondazione l� embrione allo stadio di blastocisti raggiunge la cavit� uterina e al 5� si libera della zona pellucida � hatching� che lo proteggeva dall�aderire alle pareti materne. L�utero sostenuto dagli ormoni ovarici ha una finestra di impianto di tempo limitato in cui secerne proteine e molecole che facilitano l�adesione e l�annidamento dell�embrione . L�embrione produce BHCG che �avvisa� l�organismo materno ed il PAF che modifica le reazioni immunitarie materne. Le integrine, recettori transmembrana espressi sia dalla madre che dall�embrione guidano l�interazione fra i villi coriali e e l�epitelio deciduale dell�utero.

30. DALLA BLASTOCISTI AL DISCO EMBRIONALE All�8 giorno dalla fecondazione, appare la cavit� amniotica e le cellule della massa cell interna assumono la forma di un disco bilaminare detto disco embrionale composto da due tipi cellulari ( ectoderma ed endoderma ) Al 14�giorno compare presso la regione caudale del disco un gruppo di cellule istologicamente differenti , detto stria primitiva chiamato mesoderma : da questi 3 strati derivano tutti i tessuti e gli organi.

37. L�EMBRIONE �LA COSTRUZIONE DELL�EMBRIONE E� AUTONOMA, GUIDATA DA UNA LEGGE INTRINSECA SECONDO UN PROGRAMMA BEN DEFINITO DAL PRIMO ISTANTE DELLA SUA COMPARSA.� ( A.Serra � L�uomo-embrione�Ed Cantagalli) �Ci� che � chiaro � che i biologi dello sviluppo non considerano pi� gli embrioni precoci di mammiferi come informi mucchi di cellule .� ( H.Pearson.� Your destiny from day one� Nature 2002)

38. L�embrione umano

39. L�EMBRIONE OGGETTO DI STUDIO E DI RICERCA CELLULE STAMINALI EMBRIONALI CLONAZIONE EMBRIONI IBRIDI TECNICHE DI FECONDAZIONE ASSISTITA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO CONGELAMENTO DEGLI EMBRIONI RIDUZIONE EMBRIONALE DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO INTERRUZIONE VOLONTARIA DI GRAVIDANZA

40. IL RAPPORTO WARNOCK

41. LE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI Cellule staminali sono non specializzate, cio� non ancora differenziate in uno specifico tipo di tessuto, che si dividono dando origine a: una cellula uguale staminale una cellula precursore di una linea cellulare matura, di uno specifico stipite , in grado di riprodursi

42. LE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI C.S. EMBRIONALI � derivano dalla regione interna dell�embrione detta Massa Cellulare Interna, deputata alla formazione propria dell�embrione e sono totipotenti. cellule staminali che possono dare origine a tutti i tipi di tessuto

43. LE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI.QUALI FONTI ? 1) embrioni � sovrannumerari � prodotti nelle tecniche di FIVET allo stadio di blastocisti, prima del 14� giorno 2) embrioni prodotti a scopo di ricerca allo stadio di blastocisti o allo stadio di morula o blastocisti precoce.

44. LE CELLULE STAMINALI EMBRIONALI. QUALI FONTI 3) clonazione � terapeutica� a - nucleotransfer di una cellula del soggetto in un ovocita umano enucleato : blastocisti �massa cellulare interna-cellule staminali embrionali b - nucleotransfer di una cellula di un dato soggetto in un oocita enucleato di un altro soggetto c - riprogrammazione del nucleo di una cellula di un dato soggetto nel citoplasma di cellule ES dando luogo a cybrids

46. LA DIAGNOSI PRENATALE Metodi di diagnosi che prima della nascita hanno lo scopo di valutare il benessere fetale e permettono di identificare patologie nell�embrione e nel feto. Malattie genetiche Anomalie comosomiche Malformazioni Danni da infezioni Danni da teratogeni

47. LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO �Procedure che possono eliminare embrioni umani portatori di difetti genetici prima che abbiano la possibilit� di iniziare una gravidanza�. Richieste in genere da coppie preoccupate di trasmettere ai loro figli una malattia o un disordine su base genetica di cui siano ( uno o entrambi ) portatori.

48. LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO Prime applicazioni negli anni 80 in GB in pazienti portatori di malattie genetiche legate al cromosoma x( sex-linked) Deteminato il sesso degli embrioni furono trasportati embrioni di sesso femminile ed eliminati i maschili a rischio di malattia nel 50% dei casi.

49. LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO Biopsia di un embrione allo stadio di 6 � 8 cellule / analisi dei Globuli Polari dell�ovocita Vengono rimosse per �suzione� una o due cellule La cellula viene posta in provetta in una soluzione che permette la lisi e la liberazione del DNA che viene amplificato attraverso una Polymerase Chain Reaction nella regione del gene che interessa Il tratto di DNA amplificato viene sottoposto ad analisi della mutazione specifica presente nella coppia. La procedura viene completata entro 24 ore dalla fecondazione per trasferire gli embrioni entro il 4�/5� giorno.

50. LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO Portatori di malattie monogeniche (es.Fibrosi cistica / Bthalassemia) Portatori di mal genetica curabile con trapianto di cellule staminali da CO Portatori di una mutazione che predispone a tumori ( retinoblastomi/ca seno) Portatori di mal ad insorgenza tardiva(Alzheimer/ Corea ) Coppie con abortivit� ripetuta/infertili o subfertili

51. LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO

54. LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO Efficacia nella diagnosi : 93-95% (non 100%) Eventuale contaminazione con materiale cellulare esterno Fenomeno ADO ( Allele Drop Out) 5-10% Non si esclude la presenza di malattie cromosomiche non ricercate. Si consiglia conferma della diagnosi con Villocentesi / Amniocentesi

55. LA DIAGNOSI PRENATALE PRE-IMPIANTO Tecnica FISH : Ibridazione Fluorescente in Situ ( errore : 7%) Cellule fissate su vetrino mescolate ad una soluzione con un cocktail di sonde di DNA marcate con fluorocromi colorati che si legano alle zone di DNA omologhe ed emettono luce se sollecitate con lampade a diversa lunghezza d�onda

56. CONGELAMENTO DEGLI EMBRIONI Sono destinati al congelamento gli embrioni �sovrannumerari� prodotti in eccesso rispetto all�impianto /ciclo . Non chiaro dopo quanti anni di congelamento possano essere ancora utilizzati Tasso di gravidanza pi� basso degli embrioni freschi La produzione obbedisce a criteri funzionali alle tecniche , ma in alcuni paesi � definita dalla legislazione Il numero degli embrioni trasferiti si � ridotto negli anni : oggi da 1 a 3/ transfer

57. CONGELAMENTO DEGLI EMBRIONI Istituzione della BIOBANCA: - 6 contenitori di azoto liquido per crioconservazione degli embrioni abbandonati alla data di fine marzo 2006: - a - effettiva rinuncia scritta per un futuro utilizzo per un progetto familiare della coppia - b � dopo un anno di ricerca senza esito dei genitori ( ISS)

58. GLI EMBRIONI �ABBANDONATI� Censimento in Italia 88 centri censiti : 2527 da 603 coppie in 53 centri 68 centri ancora in attesa di risposta (ISS)

59. GLI EMBRIONI CONGELATI: CHI SONO E DI CHI SONO? Tutela giuridica dell�embrione umano Problemi giuridici delle �nuove relazioni parentali� Gestione degli embrioni congelati �abbandonati� o non pi� destinati alla PMA

60. PMA: RISULTATICDC � USA � 2001 Utilizzo di embrioni congelati( 14% ) Embrioni freschi Nati vivi/transfer 33,4% Nati vivi singoli/transfer 21,4% + costi /+ invasivit� Embrioni congelati Nati vivi/transfer 23,4% Nati vivi singoli/ transfer 17,2% -costi / - invasivit�

61. LA FETO-RIDUZIONE SELETTIVA tecnica abortiva comune nei centri PMA proposta in due casi: malformazione di uno o pi� embrioni/feti in gravidanza multipla riduzione del numero di feti in gravidanza multipla (3 o 4 feti o pi�), a gravidanza gemellare o trigemina Praticata alla 8�-14� sett Preceduta spesso da DIA prenatale Attuata con iniezione di cloruro di potassio nel torace fetale, sotto guida eco Gravata da rischi di aborto e parto prematuro dei feti residui

62. LA FETO-RIDUZIONE SELETTIVA In realt� ci sono pi� gravidanze trigemine che non nati da gravidanza trigemina. Le gravidanze trigemine possono essere ridotte a gravidanze gemellari o singole prima del parto. Questo pu� accadere spontaneamente oppure il medico e la madre possono decidere di procedere alla riduzione embrionale, per ridurre il numero dei feti. Le informazioni sulle riduzioni embrionarie sono incomplete e comunque non fornite in questa sede. ( ART CDC 2005)

63. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO Negli ultimi 50 anni � aumentata in modo esponenziale la richiesta di indagini che durante la gravidanza permettano il riconoscimento di difetti o malformazioni fetali.(3% pop gen) Aumentate conoscenze scientifiche su malformazioni e difetti genetici e rischio genetico Aumentata capacit� diagnostica Riduzione del numero di figli/coppia nel mondo industrializzato Richiesta esplicita di �figlio sano� Ricerca tardiva del primo concepimento Legislazioni su IVG

64. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO 4 gruppi di malattie diagnosticabili: Anomalie cromosomiche Malattie geniche Malformazioni congenite Infezioni fetali

65. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO

66. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO INVASIVA PRELIEVO VILLI CORIALI (CVS) AMNIOCENTESI NON- INVASIVA ECOGRAFIA (Soft markers) TRASLUCENZA NUCALE BI-TEST TRI-TEST OSSO NASALE RICERCA SANGUE FETALE NEL PLASMA MATERNO

67. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO INVASIVA PRELIEVO VILLI CORIALI: Prelievo transcervicale o transaddominale di materiale placentare per indagine genetica molecolare/cromosomica Eseguito fra 10�e 13� settimana di gestazione Sotto guida ecografica / Nessuna preparazione specifica Consenso informato

68. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO INVASIVA AMNIOCENTESI: Prelievo transaddominale di 20 cc di liquido amniotico sotto guida ecografica Coltura di cellule di cute o mucose fetali per studio cariotipo fetale Eseguita tra 15� e 17� settimana Nessuna preparazione specifica Consenso informato In Italia prevista dal SSN dai 35 anni della madre

73. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO NON INVASIVA BI-TEST/ DUO-TEST. Screening biochimico: dosaggio su sangue materno BHCG e PAPP-A + esame ecografico per datazione Si esegue alla 10�-14� settimana Aumento HCG e diminuzione PAPP-A aumentato rischio di SDR Down Attendibilit� al 60% DUO TEST + NT 80%

74. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO NON INVASIVA TRANSLUCENZA NUCALE: Screening ecografico transaddominale o transvaginale Si esegue tra la 11� e la 14� settimana Aumento spessore per accumulo transitorio di liquidi associato ad anomalie del cariotipo e malformazioni cardiache ( SDR Down) Attendibilit� al 70% DUO-TEST+ NT attendibilit� al80-85%

75. LA DIAGNOSI PRENATALE POST-IMPIANTO NON INVASIVA TRI-TEST: Screening biochimico:dosaggio su sangue materno di alfa fetoproteina+ BHCG+estriolo non coniugato Associato ad esame ecografico per datazione AF ridotta (25-30%)+ BHG aumentata+estriolo ridotto aumentato rischio SDR Down Attendibilit� al 60%

77. CHE FARE DOPO LA DIAGNOSI PRENATALE L'esclusione di anomalie congenite fetali, tramite le menzionate tecniche di indagine prenatale, libera la donna da stati d'ansia, consentendole di vivere la gravidanza con serenit�. Un'anomalia fetale, diagnosticata in gravidanza, pu� essere trattata con opportuni provvedimenti terapeutici o interventi mirati. In presenza di un'anomalia grave, tale da determinare un grave pericolo per la salute fisica o psichica della madre, si pu� ricorrere all'interruzione della gravidanza, entro le 24 settimane compiute, ai sensi della legge 194. (sismer)