Contagem de Microrganismos Viáveis & Método Geral de Identificação de Patógenos

1. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Contagem de Microrganismos Viáveis&Método Geral de Identificação de Patógenos Daiane Bridi Leonardo Chaiben Neura Stella Renata Maggi

2. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA CONTAGEM DE MICRORGANISMOS VIÁVEIS EM PRODUTOS QUE NÃO NECESSITAM CUMPRIRO TESTE DE ESTERILIDADE Fonte: www.umwelt-sc.com.br

3. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Contagem de Microrganismos Viáveis Totais • Determina o n° de bactérias e fungos em produtos e MP não estéreis; • Contagem por crescimento visível: • 4 dias – Ágar Caseína-soja(30 -35°) • 7 dias – Ágar Sabouraud-dextrose(20 -25°) • Determinação: Fonte: www. hotfrog.com.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

4. unb.br IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA • Amostragem: • Técnicas Assépticas; • Amostras: • Três – início • Quatro – meio • Três – Final • Teste: • Diluição O teste é realizado com a mistura das amostras. Diluição das amostras (dentro dos limites) UFC dentro dos limites do método a ser usado. Fonte: www.unb.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

5. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Filtração Por Membrana • Tipos de Membrana • Nitrato de Celulose • Acetato de Celulose • Cuidados Especiais: • Proteger do contato direto da luz ultravioleta; • Proteger contra aerossóis; • Evitar contaminação; • Utilizar capela de fluxo laminar; • Executar ensaios de contagem de partículas, velocidade e direção do ar; Porosidade máx. 0,45 µm Fonte: www.typesolution.pt Materiais Esterilizados por Autoclavagem Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

6. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Amostra de 10 mL ou diluição que represente 1g • Método Membrana De Nitrato de Celulose Filtrar imediatamente Fonte: www. pt.vwr.com Fonte: www. pt.vwr.com Lavar as Membranas 3 vezes (100 mL de Líquido Estéril) 1º Membrana Placa de Petry com Meio I Ágar Caseína-Soja 2º Membrana Placa de Petry com Meio II Ágar Sabouraud-Dextrose Incubar 4 dias (30-35°C) Incubar 7 dias (20-25°C) Calcular o n° de Microrganismos por mL ou g de amostra Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

7. IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Preparação das Amostras: • Substâncias Solúveis em Água 10 g ou mL de mistura de amostras + 90 mL de Tampão Fosfato(pH 7,2) 6,5 – 7,5 HCL e NaOH 0,1 M Fluido I: 1 g de digestopeptido de tecido animal + 1000 mL H2O (pH 7,1 ± 0,2) Agitar / Ajustar pH 2 x 10 mL Completar 100 mL + 90 mL de Fluido I + 90 mL de Fluido I Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido I Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Fonte: www.cial-paulinia.com.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

8. IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Preparação das Amostras: • Substâncias Oleosas Miscíveis em Água: 10 g ou mL de mistura de amostras + 90 mL de Fluido II a 45 – 48°C Fluido II: 1 g de digestopeptido de tecido animal + 1 mL de Polissorbato 80 + 1000 mL H2O (pH 7,1 ± 0,2) 6,5 – 7,5 HCL e NaOH 0,1 M Agitar / Ajustar pH 2 x 10 mL Completar 100 mL + 90 mL de Fluido II + 90 mL de Fluido II Filtrar e lavar as membranas 3 vezes com fluido II Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

9. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Preparação das Amostras: • Substâncias Solúveis em Miristato de Isopropila: 6 amostras de 1g ou 1ml de mistura de amostras Completar 100 mL com miristato de isopropila (45 – 48°C) Filtrar cada solução com membrana filtrante (para cada uma) Agitar Lavar as membranas com caldo nutriente esterilizado por filtração e aquecido a 45-48°C 3 membranas em Placa de Petry com Meio I Obs: para produtos de uso tópico – teste adicional – 1 membrana para placa com ágar para fermentação de anaeróbicos, incubando em jarra para anaeróbicos a 30-35°C por 3 dias. 3 membranas em Placa de Petry com Meio II Incubar, contar as colônias e calcular o n° de microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

10. IPOOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa • Bactérias Ou Placas de Petry 100 x 20 + 1 ml de mistura de amostras + 15-20 ml de meio I liquefeito a 45°C Dispensar a mistura e amostras na superfície do meio solidificado na placa 2 placas para cada diluição Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não ultrapasse 300 por placa. Incubar a 30 - 35°C por 4 dias Contar o n° de colônias e calcular o resultado. Fonte: www.cial-paulinia.com.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

11. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa • Fungos Ou Placas de Petry 100 x 20 + 1 ml de mistura de amostras + 15-20 ml de meio II liquefeito a 45°C Dispensar a mistura e amostras na superfície do meio solidificado na placa 2 placas para cada diluição Obs.: Diluír a amostra para q o n° de colônias não ultrapasse 100 por placa. Incubar a 20 - 25°C por 7 dias Contar o n° de colônias e calcular o resultado. Fonte: www.umwelt-sc.com.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

12. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: • Empregar no método de contagem de placas: • 1 mL de preparação de amostra contendo 10 g ou 10 mL, diluídas ou dissolvidas em 100 mL de diluente. • Cremes e Pomadas solúveis em Miristato de Isopropila: 10 g de mistura de amostras + 90 mL de caldo nutriente com 0,1% de tetradecilsulfato sódico a 45-48°C 4 alíquotas de 5 mL 4 Placas de Petry 20 x 150 mm Agitar até homogeneizar 2 Placas 15-20 mL Meio I 2 Placas 15-20 mL Meio II 45°C Teste Adicional: 2 x 1 mL da 1º diluição em placas 10 x 100 mm com 15-20 mL de Ágar p/ Fermentação de Anaeróbicos. Incubar me jarra p/ anaeróbicos 30-35°C por 3 dias. Esperar solidificar, incubar, contar as colônias e os microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

13. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: • Cápsulas Vazias: 90 mL de tampão fosfato(pH 7,2) a 45-48°C sobre 50 cápsulas 1 mL da suspensão em 9 mL de Água (5:100) Agitar até suspensão total e completar a 100 mL(5:10) Se necessário, 1mL p/ 9 mL de água (5:1000) 1 mL de cada diluição em 4 placas 20x 100 mm 2 placas 15-20 mL Meio I 2 placas 15-20 mL Meio II ( liquefeito a 45° C) Solidificar Incubar Contar as colônias e Calcular o n° de microrganismos Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www.millipore.com

14. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: • Gelatinas: 10 g de mistura de amostras + 90 mL de água estéril a 48°C (1:10) Repouso por 1 h Banho-maria a 45°C por 30 min Agitação vigorosa intercalada Se necessário, 1 mL (1:100) em 9 mL – (1:1000) 1 mL em 9 mL de água estéril (1:100) Procedimento = cápsulas vazias Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www.millipore.com

15. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: • Demais Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água: 10 g ou 10 mL da mistura de amostras + 90 mL de tampão fosfato(pH 7,2) (1:10) 1 mL + 9 mL água(1:100) Se necessário : 1mL em 9 mL de água (1:1000) Proceder conforme método de cápsulas vazias Dissolver e ajustar o pH 6,5-7,5 com Hcl ou NaOH 0,1 M • Aerossóis: 10 g ou 10 mL + 90 mL de tampão fosfato (7,2) (1:10) 1 mL + 9 mL água(1:100) Resfriar 10 recipientes em álcool e gelo seco por 1h Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Completar 100 mL

16. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa Preparação das Amostras: • Contagem de Colônias: • Contador de Colônias Apropriado • iluminação artificial controlada; • Lupa; • contador registrador. Fonte: www.cial-paulinia.com.br • Considera-se para registros de resultados as placas que apresentam até: • 300 colônias de bactérias: • 100 colônias de fungos. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988 Fonte: www.cial-paulinia.com.br

17. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método de Contagem em Placa • Contagem de Colônias: • Calcula-se a média aritmética de cada diluição em relação as placas; • Calcula-se o n° de microrganismos por g ou mL para cada diluição; • Resultados expressos em Unidades Formadoras de Colônias ( UFC) Exemplo: Fonte: www.unb.br Média: (2,93 + 1,0 + 4,1 + 1,2) x 1044 Média : 2,3 x 104 Resultados: N° de colônias nas placas < 20 = menor diluição em UFC/ g ou mL. Placas não apresentam colônias = < que diluição menor (< 10 UFC / g ou mL. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

18. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método dos Tubos Múltiplos • Método utilizado quando se espera que o produto apresente densidade bacteriana baixa. • Preparação diferenciada para amostras sólidas e amostras líquidas. Preparação das Amostras: Diluição 1:10 Amostras Líquidas Amostras Sólidas 10 g de amostra + 90 mL de diluente 1 mL de amostra + 9 mL de caldo de caseina-soja Para volumes maiores 25 g + 225 mL de diluente Pode ser adicionado de emulsificantes e neutralizantes Partindo-se da diluição 1:10, preparar 1:100 / 1:1000 a partir de Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

19. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Método dos Tubos Múltiplos Preparação das Amostras: 12 Tubos com 10 mL de caldo caseína-soja Tubos 1 / 2 / 3 Tubos 4 / 5 / 6 Tubos 7 / 8 / 9 Tubos 10 / 11 / 12 1 mL de diluente 1 mL de amostra (1:10) 1 mL de amostra (1:100) 1 mL de amostra (1:1000) Sem crescimento microbiano Incubar a 30-35°C 4 dias • Tubos com crescimento = Positivos; • Amostras que turvam o meio : • confirmação de crescimento; Alçada de cada tubo p/ novo tubo caldo caseína-soja/semear em meio sólido Incubar novamente Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

20. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Meios e Diluentes Utilizados em Contagem de Microrganismos Segundo a Farmacopéia Brasileira • Ágar Caseína-Soja (Meio I); • Ágar Sabouraud-Dextrose (Meio II); • Ágar para Fermentação de Anaeróbicos; • Caldo Caseína-Soja; • Caldo Nutriente; • Fluido I; • Fluido II; • Tampão Fosfato pH 7,2; • Tampão Cloreto de Sódio-Peptonado pH 7,0. Fonte: www.hotfrog.com.br Fonte: www.hotfrog.com.br Fonte: www.interlabdist.com.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

21. - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA MÉTODO GERAL PARA PESQUISA E IDENTIFICAÇÃO DE PATÓGENOS • Salmonella • Escherichia coli • Pseudomonas aeruginosa • Staphylococcus aureus; Produtos Farmacêuticos não estéreis Detecção de células viáveis de: MP de uso direto em fabricação Intramamária: Staphylococcussp Streptococcussp, grupo B Bacilluscereus Serratiamarcescens Corynebacteriumpyogenes Klebsiellasp Mycoplasmasp Enterobactersp Pseudomonassp Citrobactersp Nocardiasp Proteussp Cryptococcusneoformans Candidasp Patógenos devem ser Ausentes Nasal ou Respiratória: Enterobactersp Serratiamarcescens Klebsiellasp Candidaalbicans Proteussp Acinetobactersp Pseudomonascepacia Pseudomonasmaltophilia Pseudomonasstutzeri Tópica: Serratiamarcescens Klebsiellasp Pseudomonascepacia Pseudomonasmaltophilia Pseudomonasstutzeri Streptococcussp, grupo B Via Oral: Bacilluscereus Enterobactersp Candidaalbicans Aspergillusflavus e parasiticus Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

22. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Enriquecimento Não-seletivo Subst. Oleosas Miscíveis em Água Subst. Solúveis em Miristato de Isoproprila Subst. Solúveis em Água 10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Tampão fosfato 7,2 10 g ou 10 mL de amostra + 90 mL de Fluido II a 45-48°C 6 porções de 1 g ou 1 mL + 100 mL de Miristato de Isoproprila a 45-48°C Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de Fluido I Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de Fluido II Filtrar em membrana e lavar com 100 mL de caldo nutriente a 45-48°C Membrana em 300mL de caldo de enriquecimento Membrana em 300 mL de caldo de enriquecimento Fonte: www.millipore.com Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

23. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Enriquecimento Não-seletivo Pomadas e Cremes Insolúveis em Miristato de Isoproprila Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água Gelatinas 10 g de amostra + 300 mL de caldo de enriquecimento 10 g ou 10 mLde amostra + 300 mL de caldo de enriquecimento 2 porções de 5 g ou 5 mL + 300 mL de caldo de enriquecimento com 0,1% de polissorbato 80 Deixar a 48 °C por 1 h Se necessário ajustar o pH a 6,5-7,5 com HCl ou NaOH 0,1 M Se necessário ajustar pH 6,5-7,5 com HCl ou Na OH Banho-maria a 45°C 30 min Agitando em intervalos Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Incubar (30-35°C) 24 – 48 h Na ausência de um Sistema de Filtração em Membrana, pode se proceder como “ Subst. Insolúveis ou Parcialmente Solúveis em Água” Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

25. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Pseudomonas aeruginosa Ágar cetrimida + material enriquecido em meio não seletivo Método de Estrias em Superfície Confirmação • Citocromo oxidase: • 1 gt de cloridrato de N,N-dimetil-p-fenilenodiamina . • Rósea para marrom, vermelho escuro e negro em 10 a 30 min. • Produção de Fluorescência: • em ágar inclinado para deteccção de fluoresceína. Incubar a 30-37°C por 24 h. • Fluorescência do ágar em luz UV a 328-210 nm. • 99% das cepas apresentam fluorescência. • Crescimento a 41°C: • em ágar inclinado de infusão cérebro e coração. • Incubar em banho-maria ou estufa por 48 h. • 99% crescem a 41°C. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

27. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Staphylococcus aureus Confirmação Material enriquecido em meio não seletivo + ágar sal manitol-vermelho de fenol ou ágar de vogel johnson • Coloração de Gram: • cocos gram positivos; • formato de cacho de uva. • Coagulase: • reconstituição liofilizada com plasma de coelho ou cavalo em água estéril; • controle positivo e negativo em paralelo; • tubo incubados em banho a 30-37°C(verificar formação de gel); • verificar tubos em 2 / 4 / 24h; • formação de gel em 24h: teste positivo Método de Estrias em Superfície • Desoxirribose: • ágar para teste de desoxirribose com verde de metila; • repicar-se a colônia no meio; • Incuba-se a 30-37°C por 24-48h; • Fazer controle positivo; • formação de zona incolor ao redor do crescimento: desoxirribose nuclease positiva; • Deve ser positivo. Incubar a 36°C por 48h • Ágar sal manitol: colônias amareladas, lisas, circundada por zona diferente(amarelo forte); • Ágar vogle johnson: colônias negro brilhante circundade por zona amarela. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

28. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Salmonela Confirmação Repicar a colônia do meio não- seletivo p/ placa de ágar-verde brilhante • Ágar Tríplice açúcar-ferro: • Inocular a colônia; • Fura-se a base não inclinada com fio reto retirando e passando na superfície inclinada; • incuba-se a 30-37°C por 24h; • Colônias apresentam: reação alcalina( cor vermelha), parte superior inclinada e ácida na base( cor amarelada) • Se as reações forem positivas, prosseguir com demais testes. Inocular colônia em 100 mL de caldo de digestivo pancreático de caseína Incubar a 30-37°C por 24-48h Adicionar 0,5 mL do reagente Kovac e agitar suavemente • Lisina-descarboxilase: • Inocular em ágar lisina-ferro; • Incubar a 30-37°C por 24h; • Colônias apresentam: cor purpurea. Reação positiva de cor vermelha intensa. A salmonella sp. indol negativa. Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

29. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Salmonela Confirmação • Crescimento Citrato de Carbono: • Repica-se a cultura em ágar citrato de simmons inclinado; • Incuba-se a 30-37°C por 4 dias; • Colônias apresentam: cor da parte inclinada azul. Fonte: www.cial-paulinia.com.br • Urease: • Repica-se a cultura em ágar uréia inclinado; • Incuba-se a 30-37°C por 4 dias; • Colônias : típicas não produzem urease. • Fermentação da Lactose: • Repica-se a cultura em caldo lactose; • Incuba-se a 30-37°C por 24h; • Colônias: maioria das cepas não fermenta lactose, permanecendo o meio inalterado Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

30. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Transferir colônias vermelho tijolo para nova placa com ágar mac conkey Se houver crescimento heterogêneo Repicar meio não-seletivo em ágar mac conkey Incubar a colônia em ágar peptona-ferro Confirmação • Ágar de eosina-cloreto de metiltionímio: • Colônia incubada em ágar mac conkey para placa contendo ágar de eosina cloreto de metiltionímio; • Incuba-se a 30-37°C por 24h; • Colônias Podem evidenciar escherichia coli quando apresentarem cor preta, esverdeadas e brilhantes. Inocular furando a base não inclinado com fio reto / retirar e passar pela superfície inclinada Incubar a 30-37°C por 24h Escherichia coli não produz gás H2S Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

31. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação • Ágar Tríplice açúcar-ferro: • Colônia em ágar de eosina cloreto de metiltionímio inoculada em ágar tríplice açúcar-ferro; • Segue-se procedimento como a salmonella; • Colônias apresentam: • Reação alcalina(cor vermelha) e ácida(amarela) na parte superior (inclinada) ; • Ácida (amarela) na base; • Pode formar gás H2S. Fonte: www.umwelt-sc.com.br • Teste de Indol: • Inocular tubo contendo caldo de digesto pancreático de caseína com colônia em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; • Incubar a 30-37°C por 48h; • Adicinar 0,5 mL de reagente kovac; • Colônias apresentam: cor vermelha intensa(presença de indol) Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

32. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação • Teste de vermelho de Metila: • Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; • Incubar a 30-37°C por 18-48h; • Adicionar 5-6 gts de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura; • Colônias apresentam: • Cor vermelho brilhante – reações positivas fortemente ácidas; • Vermelha-alaranjadas – reações fracamente positivas; • Amarela – reações negativas • Escherichia coli é vermelho de metila positivo. Fonte: www.farturaalimentos.org.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

33. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação • Teste de Voges-Proskauer: • Colônia em caldo vermelho de metila-voges-proskauer inoculada em ágar de eosina-cloreto de metiltionímio; • Incubar a 30-37°C por 24h; • Adicionar 4 mL de indicador vermelho de metila SI por 5 mL de cultura; • Incubar a 35-37°C por 1h; • Colônias apresentam: • Cor vermelha – presença de diacetila; • Escherichia coli é voges-proskauer negativa. Fonte: www.umwelt-sc.com.br Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988

34. IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA IPOG - Instituto de Pós-Graduação MBA – Gestão Industrial Farmacêutica - POA Fase Seletiva e Testes de Confirmação Escherichia coli Confirmação • Crescimento a partir de Citrato de Carbono como única fonte de carbono: • Colônia em ágar eosina-cloreto de metiltionímio inoculada em ágar citrato de simmons inclinado; • Incubar a 30-37°C por 4 dias; • Escherichia coli não utiliza citrato como fonte única de carbono, não ocorrendo crescimento Esterilização e Acondicionamento dos Meios de Cultura Meios em Tubos Meios de Cultura Incubar a 30-35°C por 24h Conservar sob refrigeração Placas estéreis de 100 x 20 mm Tubos 18 x 150 mm 10 mL Esterilizar a 121°C por 15 min. 25 x 200 mm 15-20 mL Dissolver os ingredientes Fonte: Farmacopéia Brasileira IV, 1988