Лабораторная диагностика эндотелиальной дисфункции А.П. Щёкотова г. Пермь 17 марта 2010 г.

1. Современные аспекты лабораторной диагностики фиброза печениЩёкотова А.П. ГБОУ ВПО «Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера Минздравсоцразвития России» 20.10.2011 г. г. Пермь Лабораторная диагностика эндотелиальной дисфункции А.П. Щёкотова г. Пермь 17 марта 2010 г.

2. Актуальность исследования лабораторных маркеров фиброза печени • Рост болезней печени, особенно хронических вирусных гепатитов и патологии печени, связанной с ожирением. • Прогрессирующее течение заболевания. • ЦП страдают сотни миллионов пациентов в мире, 50% пациентов с ЦП умирают в течение 5 лет.

3. Причины фиброза и цирроза печени • Хронические вирусные гепатиты • Стеатогепатит • Токсические поражения печени • Лекарственное поражение печени • Аутоиммунным поражением гепатоцитов или билиарного эпителия • Паразитозы • Врожденная патология печени • Длительный холестаз • Метаболические нарушения, включая болезнь Вильсона, гемохроматоз • Саркоидоз • Сосудистая патология

4. Патогенез фиброза печени • Фиброз печени является результатом накопления экстрацеллюлярного матрикса и развитием грубой (рубцовой) соединительной ткани в ответ на острое или хроническое повреждение печени и закономерно ведет к циррозу. • При этом нарушается равновесие между фиброгенезом и фибролизом.

5. Активация и реверсия звездчатой клетки при повреждении и восстановлении печени

6. Молекулы, имеющие значение для печеночного фиброза • Цитокины, интерлейкины: моноцитарный хемоаттрактантный пpотеин (monocyte chemoattractant protein-1,МСР-1), ИЛ-1, 6, 10, 13, фактор некроза опухоли. • Факторы роста: тромбоцит-происходящий фактор роста, васкулоэндотелиальный фактор роста(vasculoendothelial grow factor, VEGF), фактор роста гепатоцитов, фактор роста фибробластов и др. • Пептиды: эндотелин-1 (Еt-1), ангиотензин-2 и др. • Протеазы и их ингибиторы: матрикс-металлопротеиназа-1 (кишечная коллагеназа), матрикс-металлопротеиназа-2 (желатиназа А), матрикс-металлопротеиназа-3 (стромелизин-1), матрикс-металлопротеиназа-7 (матрилизин), матрикс-металлопротеиназа-8, матрикс-металлопротеиназа-9 (желатиназа В), матрикс-металлопротеиназа-10 (стомелизин-2), тканевой ингибитор металлопротеиназы-1. • Другие: тромбоспондин, лептин, активин А, тромбин, перекиси липидов, ацетальдегид.

7. Влияние дисфункции эндотелия на звездчатые клетки печени • Дисбаланс между • оксидом азота (NO) иэндотелином (Et-1) приводит к сократимости звездчатых клеток печени, сужению синусоидов. • Повышенная выработка Еt-1 активирует звездчатые клетки печени, что способствует развитию фиброза в органе. • Активированные звездчатые клетки вырабатывают Еt-1 Hon W.M., Lee W.H., Khoo H.E. Nitric oxide in liver diseases. Annals of the New Jork Academy of sciences 2002; 962: 278 – 295.

8. Участие МСР-1 в патогенезе заболеваний печени • Активация макрофагов при выработке МСР-1 паренхиматозными клетками при воспалениии приводит к поражению клеток провоспалительными цитокинами и свободными радикалами, что способствует апоптозу, некрозу, воспалению. Участие цитокинов на ранней и поздней фазах фиброгенеза в печени (Ramm, 2009).

9. Архитектура печеночных синусоидов в норме Гепатоциты Звезчатые клетки в пространстве Диссе Синусоидальный эндотелий Купферовские клетки Фенестры в эндотелии Просвет синусоида с нормальной резистентностью кровотоку A Wynn. Cellular and molecular mechanisms of fibrosis. J Pathol 2008;214: 199–210.

10. Архитектура печеночных синусоидов при фиброзе • Активация звездчатых клеток печени стимулирует фиброз. • Происходит пролиферация фибробластов и отложение внеклеточного матрикса в печени. Архитектура печеночных синусоидов при фиброзе печени (A Wynn A. J Pathol 2008;214: 199–210.)

11. Фиброз и цирроз обратимы а-норма, в-воспаление, с-фиброз, d-цирроз, e-ремоделирование цирроза, f- «разрешение»

12. Задачи выявления и прогнозирования фиброза • Диагностика морфологической стадии заболевания (METAVIR, индекс гистологической активности Knodell, модифицированный ИГА Ishak). • Прогноз эффекта противовирусной терапии: F3 и F4 хуже отвечают на лечение, при стадии1-2 противовирусная терапия лучше переносится. • Прогнозирование развития ЦП: выявление генетических маркеров риска быстрого развития фиброза (для раннего назначения антифибротической терапии). • Оценка регресса фиброза при этиотропном или патогенетическом лечении.

13. Динамика фиброза при эффективной терапии Ламивудин, альфа- интерферон, рибаверин - регресия на 2 и более морфологические стадии по METAVIR у 50% больных хроническим гепатитом при инфекции вирусом гепатита С. Фосфатидилхолин – при алкогольном гепатите, токоферол – при стеатогепатите, кортикостероиды – при аутоиммунном гепатите. А – до лечения ХГС В – после лечения

14. Золотой стандарт диагностики степени фиброза – чрезкожная биопсия печени • Недостатки: • процедура инвазивная, • временные затраты, • возможно получение неинформативных • образцов (менее 15 мм – корректная оценка в 65%), • вариабельность морфологии (разница до 3-4 стадий фиброза), • необходим опыт биопсии (!). • Воспроизводимость – 70-80%.

15. Альтернативы биопсии Неинвазивные тесты оценки фиброза: • инструментальные методы (эластография) • количественные методы оценки функции печени (непрямые лабораторные маркеры фиброза), • маркеры синтеза и деградации экстрацеллюлярного матрикса в печени (прямые маркеры фиброза).

16. Прямые биохимические тесты диагностики фиброза печени • Маркеры, характеризующие: метаболизм в клеточном матриксе (фиброгенез и фибролиз) и/или изменения в стеллатных клетках. • Это: гиалуроновая кислота (hyaluronic acid, HA), коллагены IV и VI, аминотерминальный фрагмент проколлагена III (PIIINP), матриксные металопротеиназы и TIMP-1 - тканевой ингибитор металлопротеиназы 1. • ГК позволяет стратифицировать стадии фиброза: минимальный фиброз при ХГ и выраженный фиброз при переходе заболевания в стадию ЦП с ДЧ=80% и ДС=80% по сравнению с биопсией при точке разделения 183,5 нг/мл. (Saitou Y., Shiraki K., Yamanaka Y., et al. Noninvasive estimation of liver fibrosis and response to interferon therapy by a serum fibrogenesis marker, YKL-40, in patients with HCV-associated liver disease. World J Gastroenterol  2005;11(4):476-81). • Прямые маркеры могут повышаться при системных воспалениях или при почечной недостаточности.

17. «Печеночные панели», включающие прямые маркеры фиброза • ELF test: ГК, PIIINP и TIMP-1 • MP3: PIIIN и MMP-1 • Larrousse M., et al 2007. ГК, TIMP-1

18. Непрямые тесты фиброза печени • Это традиционные сывороточные маркеры, характеризующие изменение функции печени, высвобождаемые в кровь из-за поражения гепатоцитов: • аминотрансферазы (АЛТ и АСТ), молекулы, синтезируемые, регулируемые или секретируемые печенью, например, аполипопротеин А1, альфа-2-макроглобулин (А2М), ферритин, гаптоглобин, факторы свертывания, холестерин и билирубин, маркеры патологий, которые возникают при повреждении функции печени, например, глюкоза, количество тромбоцитов и т.д.

19. «Печеночные панели», включающие непрямые маркеры фиброза • AST/ALT ratio (AAR): АЛТ/АСТ • FibroIndex: АСТ, гамма-глобулин, количество тромбоцитов, • Model 3: АСТ/АЛТ, протромбиновое время • FIB-4: АЛТ/АСТ, количество тромбоцитов, возраст • Fibrotest: А2М, гаптоглобин, Апо1, ГГТ, билирубин. • Wai CT et al. 2003: АСТ, щелочная фосфатаза, количество тромбоцитов. • Hui AY et al. 2005.. Билирубин, альбумин, количество тромбоцитов, индекс массы тела. • Forns’ score: ГГТ, холестерин, количество тромбоцитов, возраст. • ActiTest: А2М, гаптоглобин, Апо А1, АЛТ, АСТ, ГГТ, билирубин • FibroMaxTest.: А2М, гаптоглобин, Апо А1, АЛТ, АСТ, ГГТ, триглицериды, билирубин, холестерин, глюкоза, пол, возраст, вес, рост.

20. Коэффициент де Ритиса как маркер выраженного фиброза печени (AAR) • Соотношение АСТ/АЛТ более 1 предполагает наличие цирроза (Williams AL, Hoofnagle JH., 1988 ). • При инфекции ВГС соотношение более 1 имеет 100% специфичность как позитивный предиктор для дифференциации пациентов с циррозом и без цирроза печени и 53,2% чувствительность. При этом как негативный предиктор в - 80,7%. • При алкогольной болезни печени АСТ/АЛТ >1.

21. Тест, включающий непрямые маркеры фиброза:индекс АСТ/тромбоциты (APRI) < 1.5>2 АСТ/тромбоциты Цирроз Фиброз умеренный Позитивная и негативная предиктивная оценка: 91% и 65% Позитивная и негативная предиктивная оценка: 65% и 95% Likewise at all. (2003)

22. Комбинированные тесты: параметры экстрацеллюлярного матрикса ирутинные маркеры • Fontana RJ et al. 2008: ГК, TIMP-1, количество тромбоцитов • SHASTA. ГК, АСТ, альбумин • FIBROSpect II: А2М, ГК, TIMP-1, • Zeng’s score: А2М, ГГТ, ГК, возраст • Hepascore: А2М, ГК. ГГТ, билирубин, возраст, пол • Fibrospect (French MULTIVIR grup): ГК, Т1МР 1, альфа2-макроглобулин может диагностировать фиброз 2-4, положительный предиктор – в 74,4%, отрицательный предикторв 75,8%, точность 75%. Это позволяет дифференцировать пациентов с умеренным/выраженным фиброзом и тех, у кого нет фиброза (ложно+ при гипербилирубинемии, некровоспалительном процессе).

23. Fibrometer • Для оценки фиброза и характеристики воспалительного процесса: при вирусном гепатите С, тест Fibrometer в 100% дифференцирует ХГ и ЦП, при алкокогольных заболеваниях печени – FibrometerA и при метаболической стеатопатии (metabolic steatopathy) - Fibrometer S. • Возраст, пол, вес, А2МГ, ГК, тромбоциты, протромбин, АСТ, АЛТ, ГГТ, билирубин, мочевина, ферритин, гликемия. • Calès P, Oberti F, Michalak S et al. A novel panel of blood markers to assess the degree of liver fibrosis // Hepatolgy. 2005.42(6):1373-1381.

24. Сравнение тестов на фиброз печени для диагностики умеренного фиброза печени • Эластография • Fibro Test • тест выраженного фиброза печени ELF. • Чувствительность тестов для диагностики умеренного фиброза составила при эластографии 80%, с помощью теста ELF – 76%, при исследовании Фибротест – 67%. • Friedrich-Rust М., Rosenberg W. et all. Comparison of ELF, FibroTest and FibroScan for the non-invasive assessment of liver fibrosis //BMC Gastroenterology. 2010; 10:103 (+8).

25. Результаты сравнения панелей Fibrotest, Fibrometer, Hepascore для дифференциации стадий фиброза (4) • Чувствительность панелей – 75, 81 и 80%. • Специфичность – 85, 85 и 89%. • При промежуточных стадиях фиброза эффективность неинвазивных маркеров не очень высока, но применение этих тестов позволяет с высокой вероятностью исключить цирроз, существенно уменьшив необходимость в биопсии. • Bottero JLacombe KGuechot J et al. Performance of 11 biomarkers for liver fibrosis asessment in HIV/HBV co-infected patients // Hepatology. 2009. Mar 20.

26. Медико-экономические стандарты диагностики фиброза и цирроза печени в Пермском крае • 1. Обязательные методы: ОАК, ретикулоциты, тромбоциты, ОАМ, общий белок крови и фракции, билирубин, АСТ, АЛТ, ЩФ, ГГТП, холестерин, амилаза, копрограмма, маркеры вирусного гепатита, УЗИ. • 2. Дополнительные методы: иммунограмма, ФГДС, сывороточное железо, медь, калий, натрий крови, медь мочи, сканирование печени, лапароскопия, биопсия печени, ЭРХПГ.

27. Цель исследования • изучить взаимосвязи маркеров фиброза, функционального состояния эндотелия и МСР-1 у больных хроническим гепатитом и циррозом печени и оценить диагностические возможности исследуемых лабораторных тестов для стратификации хронического гепатита и цирроза печени.

28. Материал исследования • 1 группа – 25 больных хроническим вирусным гепатитом С (ХГС) в фазе реактивации, возраст 38,8±14,5 лет • 2 группа – 15 больных циррозом печени (ЦП) в исходе вирусного гепатита С, возраст 49,8±12,2 лет • группа сравнения – 15 практически здоровых лиц, не имеющиех в анамнезе заболеваний печени, возраст 36,8±10,7 лет. • В предыдущих исследованиях нами было показано отсутствие взаимосвязи между выраженностью эндотелиальной дисфункции, возрастом и полом при ХГС и ЦП.

29. Критерии исключения • артериальная гипертензия • анамнестические данные за нарушение сердечного ритма и проводимости • указания на перенесенные острые расстройства мозгового кровообращения и острый инфаркт миокарда в анамнезе • сахарный диабет • бронхиальная астма • онкологические заболевания • беременность • возраст больныхмоложе 20 лет

30. Методики исследования • 1. Гиалуроновая кислота (SYSTEMS, США)– прямой маркер фиброза • 2. Коэффициент де Ритиса (АСТ/АЛТ) – непрямой маркр фиброза • 3. Маркеры эндотелиальной дисфункции (Meigs J.B., Rifai N. Biomarkers of endothelial dysfunction. JAMA 2004; 297: 1978 – 1986): • - общий оксид азота (nitric oxide, NО) (SYSTEMS, США) - многоэффекторная молекула, важнейший NO-зависимый физиологический процесс - релаксация гладкомышечных клеток сосудов, • - эндотелин (endothelin-1, Еt-1) (BIOMEDICA CRUPPE, США) -- мощный вазоконстриктор, стимулирует пролиферацию и ремоделирование сосудов, фиброз, • - функциональная активность фактора Виллебранда (von Willebrand factor, vWF) (Technoklon vWF:CBA ELISA, США) – опосредует адгезию тромбоцитов к субэндотелию, участвует в межтромбоцитарном взаимодействии, • - васкулоэндотелиальный фактора роста (vasculoendothelial grow factor, VEGF) (Вектор-Бест, Россия) - стимулирует процессы ремоделирования сосудов и неоангиогенез, • - десквамированные эндотелиоциты (ДЭЦ) в плазме крови по методу Hladovec (1979) на 104/л – маркер повреждения эндотелия • 4. Моноцитарный хемоаттрактантный протеин-1 (МСР-1) (Вектор-Бест, Россия) – активатор макрофагов и звездчатых клеток

31. Гиалуроновая кислота (HA, нг/мл)и АСТ/АЛТ 3 2,37 3 506,5 2 0,83 1 0,8 2 70,4 1 17,8 Р1-2=0,02 р1-3=0,007 р2-3=0,0001 р1-3=0,02 р2-3=0,001

32. Показатели эндотелиальной дисфункции: оксид азота (мкмоль/л) и эндотелина-1 (фмоль/л) 1 3 2 2 3 1 Et-1 NO Р1-2=0,001 Р2-3=0,01 р1-3=0,005 Р2-3=0,007

33. Показатели эндотелиальной дисфункции: васкулоэндотелиальный фактор роста (VEGF,пг/мл) и активность фактора Виллебранда (vWF, %) 3 3 2 2 1 1 vWF VEGF Р1-2=0,007 Р2-3=0,02 Р1-2=0,01 Р2-3=0,001

34. Показатель повреждения эндотелия – десквамированные эндотелиоциты (104/л) и МСР-1 (нг/мл) Р1-2=0,03 Р2-3=0,006 Р1-2=0,00002 Р2-3=0,04

35. Взаимосвязи маркеров фиброза, эндотелиальной дисфункции при хроническом гепатите Еt-1 r=0,74 Р=0,02 НА VEGF r=0,5 Р=0,01 ФВ r=0,8 Р=0,04 NO r=-0,85 Р=0,01 СОЭ r=0,8 р=0,004

36. Взаимосвязи маркеров фиброза, эндотелиальной дисфункции и МСР-1 при хроническом гепатите Еt-1 r=0,9 Р=0,0004 МСР-1 r=-0,6 р=0,004 АСТ/АЛТ ДЭЦ r=0,88 Р=0,0001 NO r=-0,8 Р=0,0001 VEGF r=0,4 Р=0,02 0,4

37. Взаимосвязи МСР-1, параметров фагоцитоза и маркеров эндотелиальной дисфункции при циррозе печени тромбоциты r=-0,74 Р=0,03 Нв r=-0,6 р=0,02 НА Еt-1 r=0,96 Р=0,0004 ВЭФР r=0,8 Р=0,02 АСТ/АЛТ r=0,8 р=0,04

38. Взаимосвязи маркеров фиброза, эндотелиальной дисфункции и МСР-1 при циррозе NO r=-0,9 Р=0,04 НА r=0,8 р=0,04 АСТ/АЛТ Нв r=-0,84 Р=0,0001 VEGF тромбоциты r=-0,84 Р=0,01 r=0,9 Р=0,03

39. Операционные характеристики тестов для дифференциальной диагностики гепатита и цирроза печени Точки разделения 1,5 120 17 0,8 7,1 260 105 175 АСТ/АЛТ НА МСР-1 NO Et-1 ДЭЦ VEGF vWF нг/мл нг/мл мкммоль/л фмоль/л 104/л пг/моль %

40. Заключение • Выраженность маркеров фиброза и эндотелиальной дисфункции в сыворотке крови при ЦП существенно выше, чем у здоровых лиц и у больных ХГ. Показатели поражения эндотелия при ХГ и у больных ЦП в большинстве случаев демонстрируют взаимосвязь с прямыми и непрямыми маркерами фиброза печени – ГК, коэффициентом де Ритиса, тромбоцитами, Нв, билирубином, СОЭ.

41. Содержание OА, Ет-1, ВЭФР, ФВ и ДЭЦ в крови может использоваться для дифференциации минимального фиброза при ХГ и выраженного фиброза при ЦП с чувствительностью 73-92%, специфичностью 50-88% и эффективностью – 69-86%.

42. Благодарю за внимание ! Благодарю за внимание!

43. Оценка диагностической эффективности лабораторных тестов Кумулятивная кривая для ХГС 100 90 80 70 60 Количество больных,% 50 Кумулятивная кривая для ЦП 40 30 20 10 0 150 250 350 450 50 VEGF, пг/мл Точка разделения -250 пг/мл Власов В.В. Введение в доказательную медицину. – М.: МедиаСфера, 2001.

44. Определение диагностической чувствительности (ДЧ), диагностической специфичности (ДС) и диагностической эффективности (ДЭ) VEFR: • ДЧ (Se) = Истинно положительные результаты (ЦП > 250 пг/мл) : все результаты (ЦП) • ДС (Sp) = Истинно отрицательные результаты (ХГ <= 250 нг/мл) : все результаты (ХГ) • ДЭ (Е) = Сумма истинно положительных и истинно отрицательных результатов : все результаты (ХГ+ЦП) • Se= 83% • Sp= 69% • E= 78%