Prof. Ramón Garduño Juárez Modelado Molecular Diseño de Fármacos

1. Introduccióna las Técnicas de Modelado Molecular Prof. Ramón Garduño Juárez Modelado Molecular Diseño de Fármacos

2. Campos de Fuerza • Una barrera física hecha de energía para proteger a una persona u objeto de ataques o de intrusos … • Forma funcional y conjunto de parámetros usados para describir las interacciones (fuerzas, potenciales) dentro de un sistema de partículas.

3. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Las Técnicas de Modelado Molecular son un Componente Crítico en la Determinación de la Estructura de Proteínas por RMN: • Las estructuras de proteínas son calculadas al acoplar las funciones tradicionales del modelado con datos experimentales de RMN • Modelado Molecular/MecánicaMoleculares un método para calcular la estructura y energía de moléculas basado en movimientos nucleares. • los electrones no están considerados explícitamente • encontraremos una distribución óptima una vez que la posición de los núcleos sean conocidas • la aproximación Born-Oppenheimer a la ecuación de Shrödinger • los núcleos son más pesados y se mueven más lentamente que los electrones • los movimientos nucleares (vibraciones, rotaciones) pueden ser estudiados separadamente • los electrones son lo suficientemente rápidos para ajustarse a cualquier movimiento del núcleo El modelado molecular trata una molécula como la colección de pesos conectados con resortes, donde los presos representan al núcleo y los resortes representan las uniones.

4. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Campo de Fuerza: se usa para calcular la energía y la geometría de una molécula. • Colección tipos de átomo (para definir los átomos en una molécula), parámetros (para longitud de enlace, ángulos de unión, etc., y ecuaciones (para calcular la energía de una molécula) • En un campo de fuerza, un elemento dado puede tener varios tipos de átomo. • Por ejemplo, la fenilalanina contiene tanto carbonos sp3-hibridizados como carbonos aromáticos. • los carbonos sp3-hibridizados tienen una geometría de unión tetraedral • los carbonos aromáticos tienen una geometría de unión trigonal. • la unión C-C en el grupo etílico difiere de una unión C-C en el anillo fenilo • la unión C-C entre el anillo fenilo y el grupo etilo difiere de otras uniones C-C en etilbenceno. El campo de fuerza contiene parámetros para estos tipos diferentes de unión.

5. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Campo de Fuerza: se usa para calcular la energía y la geometría de una molécula. • La energía total de una molécula se divide en varias partes llamados potenciales de fuerza, • o ecuaciones de energía potencial. • Los potenciales de fuerza se calculan independientemente, y se suman para dar la energía • total de la molécula. • Ejemplos de potenciales de fuerza son las ecuaciones para las energías asociadas con el estiramiento de una unión, movimientos de tijera, esfuerzo torsional e interacciones de van der Waals. • Estas ecuaciones definen la superficie agraria potencial de una molécula.

6. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Longitud de Unión) • Dondequiera que una unión se comprime o estirada la energía aumenta. • La energía de potencial para la compresión y estiramiento de una unión se describe por • una ecuación similar a la Ley de Hooke para un resorte. • Suma sobre dos átomos • lo – longitud de unión esperada/natural • kl – constante de fuerza • l – longitud de unión actual/observada Suma sobre todas las uniones en la estructura De lo que conocemos acerca de la estructura de proteínas  lo que hemos discutido hasta este punto De la estructura Grafica de la Función de Energía Potencial para la Longitud de Unión

7. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Angulos) • Cuando el ángulo de unión se curva de la norma, la energía aumenta. • Suma sobre tres átomos • fo – ángulo de unión esperado/natural • kf – constante de fuerza • f– ángulo de unión actual/observado Suma sobre todos los ángulos de unión en la estructura De lo que conocemos acerca de la estructura de proteínas  lo que hemos discutido hasta este punto De la estructura Grafica de la Función de Energía Potencial para el Angulo de Unión

8. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Diedros Impropios) • Cuando el diedro impropio se curva de la norma, la energía aumenta. • Suma sobre cuatro átomos • wo – diedro impropio esperado (generalmente se toma a 0o) • kw – constante de fuerza • w– diedro impropio actual/observado Suma sobre todos los diedros impropios de la estructura Grafica de la Función de Energía Potencial para los Diedros Impropios (wo = 0)

9. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Angulos Diedros) • Cuando el ángulo diedro se curva de la norma, la energía aumenta. • El potencial de torsión es una serie de Fourier que toma en cuenta todas las relaciones • 1-4 entre átomos unidos. • Suma sobre cuatro átomos • fo – diedro impropio esperado • An – constante de fuerza para cada término de Fourier • – diedro impropio actual/observado n – multiplicidad (número de nodos) Suma sobre todos los diedros en la estructura … Serie de Fourier Grafica de la Función de Energía Potencial para los Diedros Mínimos Múltiples

10. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Angulos Diedro) • Necesidad de incluir términos de alto orden de uniones no simétricas • Distinguir entre conformaciones trans, gauche Diferentes multiplicidades identifican cuales ángulos de torsión son energeticamente equivalentes Para c1, 60, -60 & 180 todos son equivalentes y deberán producir una energía de torsión de 0

11. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Interacciones No enlazantes ) • Interacción de van der Waals • Actúa solo a distancias muy cortas • Interacción atractiva debido a dipolos inducidos entre átomos cargados ~ r6 • Cuando los átomos están muy juntos, la coraza de valencia comienza a traslaparse y a repelerlos ~ r12 Función de energía potencial de van der Waals Se hace repulsiva Primero es atractiva

12. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Interacciones No enlazantes) • Interacción electrostática • Interacción electrostática de átomos cargados • Fuerzas de largo alcance • Ley de Coulomb Ley de Coulomb Interacción positiva que aumenta inversamente con la distancia Interacción negativa si son de la misma carga

13. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Interacciones No enlazantes) • Interacción electrostática • Problema  definir la constante dieléctrica (e) • La constante dielectrica difiere entre el disolvente y el interior de la proteína • eproteína ~ 2-4 • edisolvente ~80 • Para los cálculos de proteínas empleando restricciones de RMN, generalmente se apaga el término electrostático • ¿Cómo definir adecuadamente el disolvente, los buffers, la sales, etc? • Definir explícitamente al disolvente  aumenta la complejidad de los cálculos. • Con el electrostático apagado durante el cálculo de la estructura, se puede usar el cálculo de la energía potencial posteriormente para determinar la calidad de la estructura de RMN

14. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Interacciones No enlazantes) • Interacción electrostática • Problema  definir la constante dieléctrica (e) • No use la energía potencial electrostática durante el cálculo de la estructura • Use una constante dieléctrica simple • eproteína ~ 2-4; edisolvente ~80 • Use disolvente explicito en el cálculo de la estructura • Mejora la calidad de la estructura • Aumenta el tiempo de cómputo • Define adecuadamente al disolvente • Define adecuadamente el comportamiento del campo de fuerza en el disolvente PROTEINS: Structure, Function, and Genetics 50:496–506 (2003)

15. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • ¿Por qué la Función de Energía Potencial No es Suficiente para plegar una Proteína? • Esta No es una función completa • principalmente la geometría de corto alcance tiene muchas soluciones iguales • VDW y electrostática solo contribuyen en distancias cortas • ¿Cómo se traerían regiones distantes de la cadena principal en contacto? • Demasiadas posibles conformaciones • 3N donde N es el numero de amino ácidos • Otros factores que guían el proceso del plegado en proteínas • interacciones hidrofóbicas, formación puente de hidrógeno, interacciones de estructura secundaria (dipolo en la hélice), efectos de disolvente, compactación de la estructura, etc • ¿Cómo se definiría una ecuación matemática que incluya estas contribuciones? Mejorando la Función de Energía Potencial, mejorar los parámetros y definir métodos ab initio alternativos del plegado en proteínas son áreas muy importantes en la investigación del Modelado Molecular.

16. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Una Forma de Ver la Determinación de la Estructura de una Proteína con RMN es como Una Estructura Modelada de Manera Hibrida • Los cálculos de estructura por RMN modifican la función de energía potencial estándar para incluir restricciones experimentales de RMN • restricciones en la distancia (NOEs) • restricciones en los diedros (NOEs, constante de acoplamiento, desplazamiento químico) • desplazamientos químicos (1H, 13C) • constantes de acoplamiento dipolar residual (RDCs) • Recientemente, funciones de potencial adicionales se han añadido y que no son restricciones experimentales de RMN pero que se han desarrollado para analizar bases de datos y tendencias estructurales. • Controversial • No son datos experimentales verdaderos • pero similares a otras funciones geométricas parametrizadas (longitud de unión, ángulos etc) • estructuras sesgadas a las estructuras en PDB • pero este es el criterio usado para determinar la calidad de una estructura de proteína ETOTAL = Echem + wexpEexp Eexp = ENOE + Etorsion + EH-bond + Egyr + Erama + ERDC + ECSA + Epara Echem = Ebond + Eangle + Edihedral + Evdw + Eelectr

17. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Base de Datos de Ramachandran • similar en concepto a la longitud de unión, ángulo de unión, etc. Paramétros dirigidos hacia f, y, c1 & c2. • basada en valores observados en el PDB. • Radio de Giro • basado en tendencias observadas en el PDB relacionadas con la longitud de la secuencia • trata de mejorar la compactación de las estructuras de RMN • tendencia general de una estructura en la ausencia de disolvente explícito a moverse hacia una conformación de cadena abierta/expandida • Potencial Empírico de Unión Esqueleto-Esqueleto • basado en las tendencias observadas en el PDB relacionadas con los puentes de hidrogeno en estructuras secundarias y puentes de hidrógeno aislados a grandes distancias. • optimiza las distancias de puentes de hidrógeno y parámetros angulares Convergence of NMR structure

18. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • restricciones de distancia (NOE) • distancia al objetivo con límites superior e inferior asignar ( resid 14 y nomb HD* ) ( resid 97 y nomb HD* ) 4.0 2.2 3.0 No hay contribución a la energía potencial global si la distancia entre los átomos está entre los límites superior e inferior de la restricción de RMN

19. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular . . . noe reset nrestraints = 20000 ceiling 100 class all @noe.tbl averaging all cent potential all square scale all $knoe sqconstant all 1.0 sqexponent all 2 end . . . • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • restricciones de distancia (NOE) • Muestra del Script para XPLOR assign ( resid 2 and name HA ) ( resid 2 and name HG2# ) 4.0 2.2 1.6assign ( resid 2 and name HA ) ( resid 3 and name HN ) 2.5 0.7 1.0assign ( resid 2 and name HA ) ( resid 3 and name HD1# ) 4.0 2.2 2.0assign ( resid 2 and name HA ) ( resid 3 and name HD2# ) 4.0 2.2 2.0assign ( resid 2 and name HA ) ( resid 100 and name HB# ) 4.0 2.2 2.0assign ( resid 2 and name HG2# ) ( resid 3 and name HN ) 4.0 2.2 2.0assign ( resid 2 and name HG2# ) ( resid 3 and name HD* ) 4.0 2.2 4.4assign ( resid 2 and name HG2# ) ( resid 100 and name HB# ) 4.0 2.2 3.0assign ( resid 2 and name HG2# ) ( resid 103 and name HN ) 4.0 2.2 2.0 . . . Prepara la función objetivo de Noe y limpia cualquier restricción existente Define el numero de restricciones y coloca la violación máxima de energía para una restricción sencilla Asigna un nombre a la clase de restricciones y lee un archivo que contiene las restricciones en la distancia. Puede leer archivos múltiples con diferentes nombres de clase. Permite la flexibilidad de tratar las diferentes clases de NOEs de manera diferente. Define como las distancias y las energías son calculadas Cual clase de NOE

20. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • restricciones de distancia (NOE) • Muestra del Script para XPLOR • Promedios – determina como se calcula la distancia entre los grupos de átomos elegidos (pseudoatomos). Factor de escalamiento para picos ambiguos en multimeros simétricos Dependencia de R-6 sobre NOE AVERAGE = R-6 AVERAGE = R-3 AVERAGE = SUM Promedio sobre todas las posibles combinaciones de distancia Ejemplo si dos distancias 3 y 10 Å ((3-6 + 10-6)/2)-1/6 = 3.37 Å Suma sobre todas las posibles combinaciones de distancia Ejemplo si dos distancias 3 y 10 Å (3-6 + 10-6)-1/6 = 2.99 Å La SUMA se prefiere sobre R-6 para picos cruzados ambiguos de NOESY AVERAGE = CENTER Diferencia entre los centros geométricos de los átomos (restricciones de distancia tienen que ser corregidas para promediar el centro)

21. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • restricciones de distancia (NOE) • Muestra del Script XPLOR • Promedios ¿Qué es Mejor (R-6, SUM,CENTER)? Punto de Discusión en la Comunidad de NMR Diferentes límites superior/inferior de Val H’s a Hg1 dependiendo en los varios promedios de distancia

22. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • restricciones de distancia (NOE) • Muestra del Script para XPLOR • Potencial – determina como se calculan las energías para las violaciones de las restricciones de distancia • La Función de Pozo-Cuadrado se usa comúnmente • escala – determina la magnitud de la función (constante de fuerza) típicamente 20-50 kcal/mol • techo– máxima violación energética por restricción Función Cuadrado-Suave Función Pozo-Cuadrado Función Bi-armónica Punto de cambio Misma región plana alrededor de la distancia objetivo pero la violación energética para violaciones superiores se reduce al “punto de cambio”. Violación energética para cualquier distancia fuera de la distancia objetivo Región plana alrededor de la distancia objetivo donde la violación energética es cero. Igual energía para violaciones superior/inferior

23. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • Restricciones de Angulo Diedro • ángulo diedro objetivo con límites superior e inferior • similar a la función de pozo-cuadrado de NOE • la diferencia en ángulo diedro (f) tiene que tomar en cuenta la naturaleza circular del los ángulos (0-360o) • Constante de fuerza (C) – determina la magnitud de la violación energética • Escala (S) – factor de peso global (permite los cambios en la contribución a la violación energética global durante el cálculo de la estructura • Exponente (ed)– aumenta la violación energética para diferencias más grandes en los ángulos diedros, usualmente 2 para armónicos. asigna (resid 1 y nomb c ) (resid 2 y nomb n ) (resid 2 y nomb ca ) (resid 2 y nomb c ) 1.0 -93.57 30.0 2

24. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • Otras restricciones de RMN y empíricas siguen el mismo patrón de las restricciones NOE y de ángulos diedros • una diferencia entre el valor observado y el objetivo determina una violación • una constante de fuerza para escalar la energía asociada con la violación Constantes de Acoplamiento: Constantes de Acoplamiento Residual Dipolar: Radio de Giro:

25. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (NMR Constraints) • restricciones en el puente de hidrógeno • basadas en una formula empírica derivada de estructuras de rayos-X de alta calidad en el PDB • la violación energética está basada en las desviaciones de los valore esperados de longitud de puente de hidrógeno (R) y ángulo (f) La violación ocurre si este término no es cero (relación entre R y f)

26. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Expected Cb secondary shifts f-1 f y+1 f+1 y y-1 • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • Restricciones en el desplazamiento químico del Carbón • diferencias los NOE esperados y observados y en los diedros • no es una función continua • Tabla “de consulta” con compartimentos (10o) que correlacionan los ángulos f,y con los desplazamientos químicos de Ca y Cb Compartimentos de diferencias esperadas en los desplazamientos químicos (relativos a los desplazamientos químicos de un alambre azaroso) para los desplazamientos químicos de Cb graficados como una función de (f,y)

27. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Ecuación de Energía Potencial (Restricciones de RMN) • Restricciones de la Base de Datos de Ramachandran • similar a las restricciones del desplazamiento químico del carbón • no es una función continua • Tabla “de consulta” con compartimentos (8o) correlacionando los ángulos f,y, c1 &c2 con la probabilidad de ocurrencia basada en el análisis PROCHECK del PDB La violación energética esta relacionada con la probabilidad de que ocurra el par observado f,y or c1,c2 y su comparación con los compartimentos vecinos. Probabilidad o numero de ocurrencias observadas para pares dados de ángulos diedro

28. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Para un Conjunto dado de Coordenadas Atómicas, se puede Calcular una Energía para la Estructura Basados en un Conjunto de Funciones de Energía Potencial ETOTAL = Echem + wexpEexp Eexp = ENOE + Etorsion + EH-bond + Egyr + Erama + ERDC + ECSA + Epara Echem = Ebond + Eangle + Edihedral + Evdw + Eelectr ¿Qué Relación tiene es Valor de Energía con Cualquier Observación Experimental? ¡NINGUNA! El valor de la energía simplemente indica que tan bien se ajusta la estructura a los parámetors esperados. Esta no indica la estabilidad relativa de una proteína respecto a otra. Esta no indica la estabilidad de la proteína (DG). Calcular una DE entre la proteína con/sin un ligando no indica la afinidad de unión del ligando o la estabilidad inducida del complejo. ¡No Sobre Interprete el Significado de esta Función de Energía!

29. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Considere Estos Hechos Acerca de las Proteínas Correctamente Plegadas: • Valores típicos de energía libre para la desnaturalización de proteínas (DGd) son ~ 10 kcal/mol • implica la estabilidad relativa de la proteína plegada comparada con la proteína desnaturalizada • En la estructura nativa de una proteína globular de 100 residuos de amino ácidos puede haber: • ~ 100 puentes de hidrógeno intramoleculares • ~ 10 puentes salinos • ~ 10 residuos hidrofóbicos enterrados • ¡Aparentemente esto imparte una estabilidad ca. -1000 kcal/mol del estado plegado! • La fuerza de las interacciones en el estado desplegado debe de ser muy similar ( ca. -990 kcal/mol). Esto sugiere que se necesita un excepcional nivel de precisión para analizar correctamente las energías de diferentes confórmeros y correctamente predecir la estructura más estable. ETOTAL = Echem + wexpEexp Eexp = ENOE + Etorsion + EH-bond + Egyr + Erama + ERDC + ECSA + Epara Echem = Ebond + Eangle + Edihedral + Evdw + Eelectr Estamos todavía muy lejos de llegar a esta meta loable.

30. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular ¿Qué Relación Existe entre las Constantes de Fuerza y las Observaciones Experimentales? Para parámetros geométricos (uniones, ángulos), las constantes de fuerza provienen de espectroscopias de IR, Raman y de cálculos ab inito. Para parámetros experimentales (NOE, diedros), ¡No existe una Relación! Las constantes de fuerza experimentales han sido determinadas por “prueba y error” o empíricamente hasta obtener un balance adecuado y contribuciones balanceadas de cada parámetro experimental de la estructura calculada.

31. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular ¿Qué Queremos Decir con un Balance Adecuado? Como ejemplo: Es más deseable el tener valores experimentales como los NOEsa tener más influencia sobre la estructura resultante que una función empírica como la base de datos de Ramachandran. Así, la constante de fuerza para las restricciones de distancia (kNOE) deberían de ser más altas que las constantes de fuerza correspondientes para el potencial de la base de datos de Ramachandran (KDB). . . . evaluate ($knoe = 25.0) ! noes evaluate ($kcdi = 10.0) ! torsion angles evaluate ($kcoup = 1.0) ! coupling constant evaluate ($kcshift = 0.5) ! carbon chemical shifts evaluate ($krgyr = 1.0) ! radius of gyration evaluate ($krama = 1.0) ! intraresidue protein evaluate ($kramalr = 0.15) ! long range protein . . . Valores típicos para constantes de fuerza experimentales/empíricas en el script de XPLOR

32. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular ¿Qué Queremos Decir con un Balance Adecuado? Estas constantes de fuerza no son absolutas y son cambiadas rutinariamente durante el cálculo de una estructura . . evaluate ($final_t = 100) { K } evaluate ($tempstep = 50) { K } evaluate ($ncycle = ($init_t-$final_t)/$tempstep) evaluate ($nstep = int($cool_steps*2.5/$ncycle)) evaluate ($bath = $init_t) evaluate ($k_vdw = $ini_con) evaluate ($k_vdwfact = ($fin_con/$ini_con)^(1/$ncycle)) evaluate ($radius= $ini_rad) evaluate ($radfact = ($fin_rad/$ini_rad)^(1/$ncycle)) evaluate ($k_ang = $ini_ang) evaluate ($ang_fac = ($fin_ang/$ini_ang)^(1/$ncycle)) evaluate ($k_imp = $ini_imp) evaluate ($imp_fac = ($fin_imp/$ini_imp)^(1/$ncycle)) evaluate ($noe_fac = ($fin_noe/$ini_noe)^(1/$ncycle)) evaluate ($knoe = $ini_noe) evaluate ($kprot = $ini_prot) evaluate ($prot_fac = ($fin_prot/$ini_prot)^(1/$ncycle)) . . Extracto de un script de XPLOR ilustrando como las constantes de fuerza son modificadas durante el cálculo de una estructura

33. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular ¿Qué Queremos Decir con un Balance Adecuado? No solamente la magnitud de la constante de fuerza puede ser modificada durante un cálculo estructura, sino también funciones objetivo específicas que se pueden encender o apagar durante el cálculo de una estructura. . . flags exclude * include bonds angles impropers vdw end . . flags exclude * include bond angle dihed impr vdw noe cdih carb rama coup coll end . . Apagar todas las funciones objetivo Extracto de un script de XPLOR ilustrando como las sanciones objetivo son apagadas y encendidas. Encender la función objetivo seleccionada

34. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular 10 Å H H C C 3 Å H H C C ¿Qué Queremos Decir con un Balance Adecuado? ¿Cómo puede la constante refuerza impactar el cálculo de la estructura? Una Simple Ilustración: restricción de distancia incorrecta La longitud de unión C-H de 1.1Å con una constante de fuerza de 410 kcal/mol Restricción en la distancia de H-H de 3.0 Å con una fuerza de 25 kcal/mol (con un techo de 100 kcal/mol) La restricción de distancia es violada (correctamente) sin distorsión en las longitudes de unión La longitud de unión C-H de 1.1Å con una constante de fuerza de 10 kcal/mol Restricción en la distancia de H-H de 3.0 Å con una fuerza de 500 kcal/mol Queremos Mantener Todos Los Valores Geométricos Conocidos Dentro De Intervalos Adecuados La restricción de distancia es satisfecha (incorrectamente) con distorsiones grandes en la longitud de unión

35. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular ¿Cómo Usamos La Función De Energía Para Calcular La Estructura De Una Proteína? ETOTAL = Echem + wexpEexp Eexp = ENOE + Etorsion + EH-bond + Egyr + Erama + ERDC + ECSA + Epara Echem = Ebond + Eangle + Edihedral + Evdw + Eelectr Minimización Molecularcomenzamos de alguna estructura (R), encontramos su energía potencial usando la función de energía potencial dada arriba. El vector de coordenadas R es luego variado usando un procedimiento de optimización para minimizar la energía potencial ETOTAL(R). Dinámica Molecularel movimiento de una molécula es simulado como una función de tiempo. La segunda ley de movimiento de Newton se resuelve para encontrar como la posición de cada átomo varía con el tiempo. Para encontrar las fuerzas en cada átomo, se calcula el vector de derivadas (o gradiente) de la de la función de energía potencial dada arriba. Factores tales como la temperatura y la presión del sistema se pueden incluir en este tratamiento.

36. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Hipótesis Termodinámica De Anfinsen • La conformación activa de una proteína es la conformación con la energía libre(DG) más baja • el mínimo global sobre la superficie de energía libre. • más bien difícil (y cara) el calcular las energías libres • por definición éstas involucran el promedio sobre un gran número de conformaciones • la secuencia primaria determina el plegado de la proteína. En 1957, Anfinsen mostró que la ribonucleasa A (124 amino ácidos, 4 puentes disulfuro) desnaturalizada producida en 8 M de urea y un agente reductor (b -mercaptoetanol) puede reactivarse al dializar el agente desnaturalizante en condiciones de oxidación

37. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Paradoja de Levinthal • Si el proceso entero de plegado fuera una búsqueda azarosa, éste requeriría de mucho tiempo. • Los estados iniciales del plegado deben de ser azarosos. • Cambios conformacionales ocurren en una escala de tiempo de 10-13 segundos. • Se sabe que las proteínas se pliegan en una escala de tiempo de segundos a minutos. • Considérese una proteína de 100 residuos: • si cada residuo tuviera solamente 3 posibles conformaciones (muy lejos de la realidad) 3100 conformaciones x 10-13 segundos = 1027 años • aún si un número significativo de estas conformaciones fueran estéricamente deshabilitadas, el tiempo desplegado sería astronómico • las barreras energía probablemente causen que la proteína se pliegue siguiendo un sendero definido

38. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Minimización Molecular • mueve las coordenadas Cartesianas (X,Y,Z) de cada átomo para obtener la energía mínima • el resultado es dependiente de la estructura inicial • encuentran mínimos locales pero no el global • típicamente, sólo movimientos pequeños en las posiciones atómicas son llevados a cabo • la estructura inicial se asemeja mucho a la estructura final • cambios muy grandes pueden ocurrir para estructuras muy distorsionadas (alargamiento de la unión) ETOTAL = Echem + wexpEexp Eexp = ENOE + Etorsion + EH-bond + Egyr + Erama + ERDC + ECSA + Epara Echem = Ebond + Eangle + Edihedral + Evdw + Eelectr El alargamiento de una unión puede invertir la quiralidad

39. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Minimización Molecular • la minimización fallara para estructuras severamente deformadas • un ligando pobremente acoplado a una proteína donde las uniones o átomos están traslapados • Para refinar adecuadamente esta pobre estructura, el protocolo de minimización necesitará regresar el Cd a través del anillo acción que requerirá primero tener una estructura de energía muy alta. • Esto no ocurrirá ya que la tendencia para la minimización es el moverse hacia una menor energía. • La estructura “minimizada” resultará probablemente con una unión Cd-Cg alargada y distorsionada en cuanto él Cd se aleja del anillo hacia otra dirección • El anillos de benceno y el resto de la cadena lateral de la Leu también serán distorsionadas en un esfuerzo de acomodar la estructura traslapada Es altamente improbable que estas estructuras se minimice ya que el Cd de la cadena lateral de Leu penetra el centro del anillo de benceno

40. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular El problema del Mínimo Local versus el Global El panorama estructural está lleno con picos y valles. El protocolo de minimización siempre se moverá “colina abajo”. No hay forma de “ver” el panorama estructural global. No hay forma de pasar a través estructuras intermediarias de alta energía para llegar a un mínimo de más baja energía. ¡La estructura inicial determina el resultado de la minimización!

41. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular El problema del Mínimo Local versus el Global Otra perspectiva del Panorama Estructural es la visión de un embudo en 3D que lleva al mínimo global en la base del embudo.

42. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Minimización Molecular • Revisión del Proceso El potencial molecular U depende de dos tipos de variables: El gradiente de la energía potencial g(Q), es un vector con 3N componentes: La condición necesaria para un mínimo es que el gradiente de la función sea cero: Donde xi denota las coordenadas Cartesianas atómicas y N es el número de átomos or La condición suficiente para un mínimo es que la matriz de la segunda derivada sea positiva definida, i.e. para cualquier vector u 3N-dimensional: Una definición operativa simple en esta propiedad es que todos los eigenvalores de F son positivos en el mínimo. La matriz de la segunda derivada se denota por F en mecánica molecular y por H en matemáticas, y está definida como: Una medida de la distancia de un punto estacionario es el gradiente de rms:

43. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Minimización Molecular • Revisión del Proceso • un mínimo ocurre cuando la primera derivada de cero y cuando la segunda derivada es positiva. • U(Q) es una función complicada que varía rápidamente con las coordenadas atómicas Q • la minimización de la energía molecular a menudo se lleva cabo en una serie de pasos • las coordenadas en el paso n+1 están determinadas por las coordenadas en el paso previo n donde dn es llamado un paso. • el paso inicial es iniciado de manera azarosa • una búsqueda sistemática o azarosa no es práctica (Paradoja de Levinthal) • Método del Descenso más Rápido • el paso de búsqueda (dn) se lleva cabo en la dirección de disminución más rápida de U, opuesto al gradiente g donde a es un factor que determina la longitud del paso. • no es eficiente, pero es bueno para estructuras inicialmente distorsionadas • puede ser muy lento cercano a la solución

44. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Minimización Molecular • Revisión del Proceso • Gradiente Conjugado (Powell) • modifica el descenso más rápido para aumentar la eficiencia • Los pasos iniciales son del descenso más rápido • el rector de paso actual no es similar a los vectores previos de paso • la información acerca de la función de energía se acumula de una iteración a la siguiente Uno o dos factores determinan cuando el cálculo de la minimización se ha completado: • se ha llegado al número definido de pasos (dn). • un valor predefinido del gradiente (g) ha sido obtenido. (el gradiente muy rara vez llega exactamente a cero)

45. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Dinámica Molecular (DM) • mueve las coordenadas Cartesianas (X,Y,Z) para cada átomo al integrar sus ecuaciones de movimiento • un cambio la posición con respecto al tiempo (aceleración) da la velocidad • sigue las leyes de la mecánica clásica, más notoriamente en la segunda ley de Newton: • la fuerza en un átomo i se puede computar directamente de la derivada de la función de la energía potencial (U) con respecto a las coordenadas ri, Fi = -dU/dri. • para iniciar la DM necesitamos asignar velocidades iniciales • Esto se hace usando un generador de números aleatorios usando la restricción de la distribución de Maxwell-Boltzmann. donde: Hamiltoniano H(G), donde G representa el conjunto de posiciones y momento Temperatura Objetivo (T) Constante de Boltzman (kB)

46. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Dinámica Molecular (DM) • La temperatura está definida por el promedio de la energía cinética del sistema de acuerdo a la teoría cinética de los gases. • la energía interna del sistema es U = 3/2 NkT • la energía cinética es U = 1/2 Nmv2 donde : N es el número de átomos v es la velocidad m es la masa T es la temperatura k es la constante de Boltzman • Al promediar sobre las velocidades de todos los átomos en el sistema la temperatura puede ser estimada. • La distribución de velocidad de Maxwell-Boltzmann será mantenida durante toda la simulación. • Si al sistema se le ha minimizado la energía  la energía potencial de cero y la temperatura de cero • Se necesita “calentar” al sistema hasta la temperatura deseada • escala las velocidades: v = (3kT/m)1/2 • Calcular una trayectoria en un espacio fase 6N-dimensional (3N posiciones y 3N momentos) • mide las trayectorias en pequeños pasos de tiempo, generalmente 1 femto-segundo (fs) • la duración típica de una corrida de dinámica es de 10-100 pico-segundos (ps)

47. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular • Dinámica Molecular (DM) • La fuerza Fi ejercida en el átomo i por otros átomos en el sistema está dada por el gradiente negativo de la función de energía potencial (V) en turno depende de las coordenadas de todos los N átomos en el sistema Para pasos pequeños de tiempo (δt), la siguiente aproximación se mantiene: • Típicamente un paso de tiempo de 1 a 10 fs se usa para sistemas moleculares. • Así una simulación de dinámica molecular de 100 ps (10-10 segundos) involucra de 105 a 104 pasos • de integración. • Aún empleando las computadoras más rápidas solamente procesos moleculares muy rápidos • pueden ser simulados al nivel atómico.

48. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Regiones Típicas de Tiempo para el Movimiento Molecular

49. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Script de XPLOR para calcular una estructura extendida a partir de un archivo PSF structure @PROTEIN.psf end {*Read structure file.*} parameter @/PROGRAMS/xplor-nih-2.9.1/toppar/parallhdg_new.pro end vector ident (X) ( all ) vector do (x=x/10.) ( all ) vector do (y=random(0.5) ) ( all ) vector do (z=random(0.5) ) ( all ) {*Friction coefficient, in 1/ps.*} vector do (fbeta=50) (all) {*Heavy masses, in amus.*} vector do (mass=100) (all) parameter nbonds cutnb=5.5 rcon=20. nbxmod=-2 repel=0.9 wmin=0.1 tolerance=1. rexp=2 irexp=2 inhibit=0.25 end end flags exclude * include bond angle vdw end minimize powell nstep=50 nprint=10 end flags include impr end minimize powell nstep 50 nprint=10 end dynamics verlet nstep=50 timestep=0.001 iasvel=maxwell firsttemp= 300. tcoupling = true tbath = 300. nprint=50 iprfrq=0 end . . Leer archivos PSF y los parámetros Manipulación matemática de las propiedades atómicas Conjunto de parámetros para la función de energía potencial no enlazante Define cuales funciones de energía potencial se usarán Ejecuta el conjunto de Minimización y Dinámica

50. Introducción a las Técnicas de Modelado Molecular Script de XPLOR para calcular una estructura extendida a partir de un archivo PSF . . parameter nbonds rcon=2. nbxmod=-3 repel=0.75 end end minimize powell nstep=100 nprint=25 end dynamics verlet nsteps=500 timestep=0.005 iasvel=maxwell firsttemp = 300. tcoupling = true tbath = 300. nprint=100 iprfrq=0 end flags exclude vdw elec end vector do (mass=1.) ( name h* ) hbuild selection=( name h* ) phistep=360 end flags include vdw elec end minimize powell nstep=200 nprint=50 end {*Write coordinates.*} remarks extended strand (PROTEIN) write coordinates output=PROTEIN.ext end stop Cambiar los parámetros no-enlazantes Otro ciclo de Minimización y Dinámica donde se añaden los hidrógenos a la estructura y ésta se refina Se guarda la estructura y se detiene