RNA metabolisme

1. RNA metabolisme Transkripsjon Winnie Eskild, IMBV 2004

2. Transkripsjon • Transkripsjon er kopiering av utvalgte områder av DNA • Bare den ene DNA-tråden kopieres • Produktet er RNA • RNA er enkelttrådet men danner så mange hydrogenbindinger mellom basene som mulig • RNA har derfor sterkt varierende og komplisert struktur

3. Intramolekylære hydrogenbindinger

4. Transkripsjon • RNA foreligger oftest i kompleks med proteiner • Blant makromolekylene har RNA det største spekter av funksjoner: • Genetisk informasjon (en del virusgenomer består av RNA) • Overføring av genetisk informajon (mRNA, tRNA) • Strukturelle funksjoner (ribosomet) • Katalytiske funksjoner (ribozymer)

5. Tre typer RNA Messenger RNA (mRNA): - bærer koden for aminosyresekvensen for et eller flere polypeptider - degraderes rask av nukleaser Transfer RNA (tRNA): - leser den genetiske koden på mRNA og bringer rett aminosyre til proteinsyntesemaskineriet - svært stabile molekyler Ribosomalt RNA: - er en strukturell del av ribosomet og katalyserer dannelsen av peptidbindingen mellom aminosyrer under proteinsyntesen - svært stabile molekyler

6. Transkripsjon Kopierer deler av DNA Kopierer bare en tråd Bare 5’-3’-retning Har ingen korrekturlesing Har ingen feilretting Er avhengig av templat Bruker ikke primer Replikasjon Kopierer all DNA Kopierer begge trådene Bare 5’-3’-retning Har korrekturlesing Har feilretting Er avhengig av templat Er avhengig av primer Transkripsjon vs replikasjon

7. E. coli DNA-avhengig RNA polymerase • Syntetiserer RNA når en DNA-templat, Mg 2+ og de fire ribonukleotider er tilstede: ATP, UTP, GTP, CTP • Reaksjonsmekanismen er svært lik DNA polymerase: et nukleofilt angrep fra oksygen i første nukleotids 3’-OH-gruppe mot fosfaten på innkommende nukleotids 5’-C-atom. Pyrofosfat spaltes fra. PPi spaltes videre til 2 Pi for av drive reaksjonen mot produktdannelse (NMP)n + NTP RNA polymerase (NMP)n+1 + PPi

8. (NMP)n + NTP RNA polymerase (NMP)n+1 + PPi 2 Pi

9. E. coli DNA-avhengig RNA polymerase • RNA tråden syntetiseres som en komplementærtråd til en av DNA-trådene. Baseparring selekterer korrekt base A U, T A, G C, C G • Dobbeltrådet DNA stimulerer RNA polymerasens aktivitet mest • RNA polymerase innkorporerer feil nukleotid for hver 104-105 base

10. RNA polymerase 2 Pi RNA- tråd U U U U

11. RNA polymerase • DNA-avhengig RNA polymerase i E.coli er et stort enzymkompleks • Det består av 6 subenheter, MW 390000 • Fem subenheter er alltid kompleksbundet: ’ • Sjette subenhet, , finnes i flere isoformer • -subenhetene har forskjellig MW og forskjellig selektivitet m.h.på promoter • 70 er den vanligste

12. Sigma subenheten • E. coli har forskjellige -subenheter med varierende MW • 70 binder seg særlig godt til promoterområdene i en gruppe gener. Dette medfører at de uttrykkes mere enn andre gener • En annen variant, 32, induseres etter f.eks høy temperatur • 32 binder seg spesielt til genene for ”heat shock” proteinene som beskytter cellens proteiner etter delvis denaturering • Ved å regulere ekspresjonen av -subenhetene kan E.coli kontrollere hvilke undergrupper av gener som uttrykkes under et gitt sett av omstendigheter

13. RNA polymerase • En RNA sekvens vises alltid i 5’-3’ retning • RNA syntetiseres i 5’-3’ retning som en komplementærtråd til templat-tråden i DNA • DNA templattråden kopieres i 3’-5’ retning • DNAs andre tråd er den kodende tråden (nontemplat tråd) • Et gens DNA sekvens vises alltid med kodende tråd i 5’-3’ retning • RNA transkriptet har samme sekvens som DNA-kodende tråd hvor T er erstattet med U

14. Transkripsjonseksempler Angi RNA-sekvensen når DNA kodende tråd sekvensen er flg: 5’-TTCGATCGCTGACTAAC-3’ RNA: 5’-UUCGAUCGCUGACUAAC-3’ Angi RNA-sekvensen når DNA templattrådens sekvens er flg: 5’-GCTTAGCTGTGCCATC-3’ RNA: 5’-GAUGGCACAGCUAAGC-3’ Angi sekvensen på DNA templat tråden når RNA sekvensen er flg: 5’-GUACAUCCUAGAUUCA-3’ DNA-templat 5’-TGAATCTAGGATGTAC-3’

15. Geners plassering på kromosomet • Gener kan ligge enten på den ene eller den andre DNA tråden • En og samme DNA tråd kan derfor være både templat- og nontemplattråd

16. Transkripsjon Transkripsjonen deles i: • Initiering • Elongering • Terminering

17. Nummerering av genelementer Oppstrømsområdet Nedstrømsområdet = transkribert del av genet - n + n -1 + 1 Første transkriberte nukleotid er nr. +1

18. Initiering av transkripsjon • Promoterområdet definerer starten på genet. Dekker området -70 til +30 • Hvert gen har sin unike promoter men promotere har også fellestrekk • Genpromotere som gjenkjennes av 70 subenheten av RNA polymerase har flg. fellestrekk: • - 10 området: et område med høyt konservert sekvens ca 10 baser oppstrøms for transkripsjonsstart, finnes i alle gener

19. Initiering av transkripsjon • - 35 området: et område med høyt konservert sekvens ca 35 baser oppstrøms for transkripsjonsstart, finnes i alle gener • Spacerne har litt varierende størrelse • -subenheten av RNA polymerase gjenkjenner flg element: • UP elementet finnes i en del høyt uttrykte gener. Posisjon -40 til -60

20. Konsensussekvenser for UP, -35 og -10 elementene Konsensus angir hvilke baser som forekommer hyppigst på de forskjellige posisjoner. Konsensussekvenser finnes ikke nødvendigvis

21. Transkripsjonsinitiering • -subenheten finner promoteren • RNA polymerase binder seg til promoteren • Forskjellige utgaver av -10-elementet og -35-elementet binder RNA polymerase i forskjellig grad. Medfører varierende basal- transkripsjon • Mutasjoner av viktige baser i -10- og -35-elementene kan ødelegge bindingen

22. Transkripsjonsinitiering • RNA polymerase binder til dobbeltrådet DNA og splitter deretter trådene • Deretter starter transkripsjonen/elongeringen og -subenheten forlater enzymkomplekset

23. Transkripsjonsboblen • E.coli RNA polymerase åpner et DNA-område på 17 basepar • En kort strekning, 8 bp, av de sist sammen-koplete ribonukleotider hybridiserer til DNA. RNA frigjøres etterhvert som syntesen skrider frem.

24. Transkripsjonsboblen • Transkripsjonsboblen flytter seg langs DNA i takt med transkripsjonen • Polymeriseringshastigheten for RNA polymerase er 50-90 nukleotider/sek. • Topoisomeraser avhjelper topologisk stress både foran og bak transkripsjonsboblen

26. Elongering • RNA polymerase har svært høy prosessivitet. • Et RNA må syntetiseres i én sammenhengende prosess. Hvis enzymet faller av må det starte fra begynnelsen igjen • RNA polymerase har ikke 3’-5’-eksonukleaseaktivitet og kan derfor ikke lese korrektur • RNA polymerase innsetter én feil base for hver 104-105 base • Dette er sjelden nok til at cellen kan leve med det • RNA med feil eller de proteiner med feil som kan bli resultatet sendes til degradering

27. Terminering av transkripsjon • E.coli har to typer termineringsmekanismer: - -uavhengige - -avhengige.  er en termineringsfaktor (protein)

28. -uavhengig terminering • Krever hårnål og polyuracilsekvens • Gener med denne mekanisme har en terminal sekvens som kan danne en hårnålstruktur • Hårnålen forekommer 15-20 baser før RNA trådens avslutning

29. -uavhengig terminering • Ved avslutningen av det området som koder for RNA finnes en polyadenin-sekvens. Denne medfører en poly-uracilsekvens i RNA • Tilstedeværelsen av hårnålen og denne ustabile polyU strekning får polymerasen til å stoppe og deretter falle av genet

30. -avhengig terminering • Polymerasen stopper ved en hårnålstruktur eller annet termineringssignal • -faktoren beveger seg hen langs RNA i 5’-3’-retning. Dette krever ATP • Når den finner et transkripsjonskompleks som er stoppet ved et termineringssignal hjelper den med frigjøring. Også dette krever ATP

31. -avhengig terminering

32. Transkripsjon er regulert • Ethvert gen uttrykkes bare i den grad og på det tidspunkt det er bruk for det • Regulering forekommer på alle trinn i transkripsjonsprosessen • Hovedsaklig reguleres initieringen

33. Transkripsjon er regulert • Hovedsaklig reguleres initieringen 1) -10 bp og -35 bp elementene har innflytelse på basalekspresjon 2) -subenhetene selekterer gengrupper for ekspresjon 3) Binding av hemmere eller stimulatorer til promoteren - E.coli bruker vanligvis glukose til energiformål. Dersom det ikke er tilgang på det, aktiveres genet for katabolitt gen aktivator (CAP). CAP aktiverer transkripsjonen av genene for en gruppe enzymer som nedbryter andre monosakkarider. Dermed skaffer E.coli energi til å overleve - Lac repressoren hemmer ekspresjon av gener for laktose- metaboliserende enzymer. I fravær av laktose er hemmeren aktiv, men i nærvær av laktose inaktiveres den og genene kan uttrykkes. På denne måte overlever E.coli når laktose er eneste energisubstrat

34. Eukaryot transkripsjon • Foregår i cellekjernen • Det finnes 3 RNA polymeraser, type I, II og III. Disse har spesifikke funksjoner og binder seg til hver sin promotertype • RNA polymerase I transkriberer ribosomalt RNA • RNA polymerase II transkriberer mRNA • RNA polymerase III transkriberer tRNA og 5S rRNA

35. RNA polymerase II promotere • Det finnes mange forskjellige pol.II promotere, men en stor del av dem har et par DNA-elementer felles • TATA-boks finnes ca 30 basepar oppstrøms for disse gener • Initiator elementet, Inr, finnes nær/overlapper transkripsjonsstart Y = pyrimidin N = G,A,T eller C

36. Primærtranskriptprosessering • Primærtranskriptet er en kopi av genet fra transkripsjonsstart til terminering • Består av eksoner (100-1000 baser) og introner (50-20.000 baser). • Under transkripsjon settes det en 5’-cap på 5’-enden av mRNA og etter transkripsjon settes en polyA-hale på 3’-enden (80-250 adenylat) • For tRNA modifiseres en del baser og ribose • Prosessering fjerner alt utenom eksoner og spleiser disse sammen • En del spleiseenzymer er ribozymer • 5’-ikke-translatert 3’-ikke-translatert ekson 1 intron ekson 2 intron ekson 3 kodende kodende kodende

37. 5’-cap på mRNA • 5’-cappen består av 7’-metylguanosin • Den bestytter mRNA mot uspesifikk degradering av eksonukleaser

38. RNA prosessering

39. Spleising Kylling ovalbumin