제한효소 (Restriction enzyme)

제한효소(Restriction enzyme)

제한효소란? # Nuclease(핵산분해효소)는 DNA를 자르는 모든 효소를 말하고 뉴클레오티드 간에 phosphodiester 결합을 끊을 때 DNA 사슬 바깥쪽에서부터 자르는가 또는 안쪽을 자르느냐에 따라 각각 exonuclease와 endonuclease로 나뉜다. Endonuclease의 대표적인 것이 제한효소인데 DNA의 특정한 염기서열을 인식하고 인식한 서열 부위 또는 그 근처를 절단한다. # 제한효소는 원래 세균이 자신의 세포 내로 침입해 들어온 바이러스와 같은 외부 DNA를 제거하기 위한 방어기전에서 발견되어 바이러스의 증식을 제한한다는 의미로 이름 지어 졌다. 이때 자신의 DNA에 있는 절단부위의 염기를 methylation시켜서 자신의 제한효소가 자신의 DNA를 자를 수 없게 보호한다.

Methylation # DNA methylase 유전자를 갖고 있는 숙주균으로부터 추출한 DNA는 염기 일부가 메틸(methyl)화 되어 있어서 그 부분을 인식하는 제한효소가 절단하지 못한다. - dam methylation 예)그림 1 - dcm methylation # 숙주균 중에 DNA methylase 를 못 만드는 dam- 균주(dcm- 균주) 를 사용하는 방법으로 해결할 수 있다. 그림 1

# 제한효소는 typeⅠ, Ⅱ 분류한다. TypeⅠ은 특정 서열을 인식하지만 인식부위가 아닌 다른 곳을 자르고, typeⅡ는 인식한 서열부위 내부를 자른다. 유전공학에서 이용하는 제한효소는 typeⅡ다.typeⅡ 제한효소가 DNA 두 가닥을 자를 때 다음 두 가지 단편이 만들어진다. • Blunt end • Sticky end(또는 cohesive end)

STAR activity # 제한효소 중에는 특정 반응 조건 하에서 사용하면 본래의 인식서열과 다른 염기서열을 절단하는 STAR 활성이 있다. 이런 STAR활성을 억제하기 위해서는 아래의 상태에서 실험하는 것이 좋다. - 낮은 글리세린 농도 - 중성 pH - 높은염 농도 예시) Conditions of low ionic strength, high enzyme concentration, glycerol concentration > 5%, or pH > 8.0 may result in star activity

회문구조(palindrome) # 제한효소가 인식하는 서열은 회문구조로 되어 있다. 회문구조는 원래의 서열을 뒤집은 것이 그것의 상보적 서열이 되는 것을 말한다. 예를 들어 서열 GGATCC의 상보적 서열은 CCTAGG인데 이것은 GGATCC를 뒤집은 것과 같다. # 수학적인 설명을 덧붙이자면 회문구조를 가지기 위해선 짝수 개의 염기쌍을 가지고 있어야 하며 가운데를 중심으로 양쪽이 상보되는 염기쌍으로 대칭을 이루어야 한다.

제한효소 관련 유용한 자료 http://www.neb.com/ # Isoschizomers # Compatible end

실험: 제한효소반응 • 주 재료 • 제한효소(EcoRІ) • 제한효소(BamH І) • 제한효소(Hind Ⅲ) • 10Xbuffer # 2 • BSA (For BamH І) • 빈 플라즈미드 벡터(pcDNA 6B) & 유전자가 삽입된 플라즈미드 벡터(pcDNA 6B EGFP-EcR) • 37°C 항온수조

(2)재료 및 장비 • - 아가로스 • - 5x TBE buffer • - Ethidium bromide Stock 10mg/ml • - 100ml 삼각플라스크 • - 전자레인지(방열장갑 착용) • 파이펫, tip • - Gel loading buffer(6X) • - DNA Size marker • - 전기영동장치 • - UV transiluminator

(2) 실험방법 1. 0.8% 아가로스 겔 만들기 2. 제한효소 처리 ① 1-2μg 플라즈미드 벡터 DNA(pcDNA 6B, pcDNA 6B EGFP-EcR)에 제한효소를처리한다. 효소 원액은 글리세롤이 들어있기 때문에 점도가 높아서 pipetting할 때 tip끝만 살짝 담근 후 따내야 한다. 효소량이 반응 총액의 10%를 넘으면 효소활성이 글리세롤 때문에 억제될 수 있기 때문에 주의해야 한다.Sample이 여러 개일 경우 master mixture를 만들어 사용한다. -10Xbuffer #2 - - - - - - - - - - 2µl -100XBSA - - - - - - - - 0.2µl -plasmid vector DNA(1-2µg) - - - 5µl -Enzyme (BamH І) - - - - - 0.5µl (10nuits) -dH2O(DNase free) - - - - - - - 12.3µl total (반응총액) - - - - - - - - - 20µl ② 37℃ 항온수조에서 15분간 반응시킨다. # 1unit: One unit is defined as the amount of enzyme required to digest 1 µg of λ DNA in 1 hour at 37°C in a total reaction volume of 50 µl.

3. 전기영동 ③ 처리군(제한 효소를 처리한 벡터)과 비교군(효소를 처리하지 않은 벡터)을나란히 loading한 후 100V로 전개한다. ④ 겔의 2/3 정도에 bromophenol blue가 오면 멈추고 겔을 uv-transilluminator로 관찰한다.

제한효소 (Restriction enzyme)